人源多菌株益生菌發酵條件的研究

印伯星，瓦云超，黃玉軍，徐廣新，顧瑞霞

（1.揚州大學，江蘇揚州225009；2.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225009；3.江蘇省乳業生物工程技術研究中心，江蘇揚州225004；4.揚州市揚大康源乳業有限公司，江蘇揚州225004）

0 引 言

發酵乳具有獨特的風味、豐富的營養物質和多種健康因子，廣受各國消費者青睞，已成為乳制品中發展最快的產品之一。中國發酵乳市場每年保持著兩位數的高速增長，增長率領跑全球，2017年產值已經超過1 000億，預計2020年中國發酵乳市場規模將近2 000億元[1]。發酵乳產品和品牌的競爭也日趨激烈，功能性發酵乳產品的研究與開發將成為下一階段乳制品發展的重點。

發酵乳品質在很大程度上取決于發酵劑的質量，并且其功能特性更加依賴于發酵菌株的益生特性。因此，在發酵乳生產前必須根據發酵乳的不同種類和生產條件的差異選定適宜菌種預先制備相應的發酵劑。其次，在保障發酵乳具有良好口感和風味的同時，還應保持發酵乳制品中存在較高的活菌數以保證其進入體內發揮益生作用。因此，新型發酵乳制品開發的核心將是優良菌株篩選、高活性發酵劑制備、新型發酵乳制備技術的研究[2]。

選用 L.rhamnosus LV108、L.casei grx12 和 L.fer?mentum grx08是實驗室從3160株分離自長壽地區人群體內的3株具有較好的耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液等特性。僅以3株人源乳桿菌組合制備發酵乳，旨在確定3株菌株復配比例及優化發酵乳制備工藝，為進一步研究開發具有降膽固醇的功能特性的人源益生菌發酵乳提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

本實驗所選用的L.rhamnosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08均由揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室提供。

MRS液體、固體培養基，12%脫脂乳培養基，生理鹽水，氫氧化鈉（分析純）。

1.2 主要儀器與設備

HH-6恒溫水浴鍋，JF-SX-500全自動滅菌鍋，日立7020全自動生化分析儀，Legend mach1.6R高速冷凍離心機，SPX-150BSH生化培養箱，CAR/PDMS75μ m萃取纖維頭，Trace DSQ氣相色譜-質譜聯用儀，Milli-Q Direct 8超純水系統，SW-CJ-1F單人雙面工作凈化臺，GYB60-08高壓均質機，BS2000S電子天平，FE20pH計，TMS-Pro質構儀。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將凍存于-80℃冰箱的實驗菌株接入MRS液體培養基中，37℃恒溫培養24 h，革蘭氏染色鏡檢是否有雜菌。確定無雜菌后，活化三代用于后續試驗。

1.3.2 人源乳酸菌益生特性測定

對菌株的耐酸能力、耐膽鹽能力、耐抗生素能力、抑菌能力、疏水性、黏附性、甘油三酯降解能力及膽固醇降解能力等安全指標和功能性指標進行測定，方法參照作者所在實驗室的測定方法[3-5]。

1.3.3 不同混合菌株發酵特性

將脫脂乳粉復原成12%(w/v)的脫脂乳，放置30 min使蛋白質充分復水后分裝每個三角玻璃小瓶100 mL（平行樣5個），95℃滅菌5 min，冷卻至37℃左右，分別以 1∶0∶0、0∶1∶0、0∶0∶1、1∶1∶1、2∶1∶1 接種 L.rham?nosus LV108、L.casei grx12和L.fermentum grx08，制成乳酸菌脫脂乳發酵劑進行發酵乳試驗。每2 h取樣測定其酸度、黏度、游離氨基酸數值，連續測定24 h。將實驗菌株按3%接種至脫脂乳培養基，42℃恒溫培養并記錄凝乳時間。

1.3.4 理化指標測定

酸度測定：參照國標GB5413.34-2010[6]的方法，用0.10 mol/L NaOH標準溶液進行滴定。

黏度測定：參照欒少萌[7]的方法進行測定。

游離氨基酸測定：樣品采用H.M.Abu-tarboush的處理方法；游離氨基酸測定采用Frank.C.Church等[8]建立的鄰苯二甲醛(OPA)法。

活菌數測定：參照陳廷續[9]方法，無菌條件下吸取樣品5 mL置于滅菌三角瓶內，加入45mL滅菌水，振蕩5 min制成1∶10稀釋液，隨后進行梯度稀釋到10-6～10-8左右，分別在做10倍遞增稀釋，選取不同稀釋度稀釋液1 mL置于滅菌平皿中，注入30 mL培養基（同時做培養基空白對照）；待瓊脂凝固后，翻轉平板，置于37℃溫箱中進行培養48 h左右，選取菌落數在30～300的平板進行計數。隨機挑取5個菌落數進行革蘭氏染色，顯微鏡進行復查，排除雜菌。

1.3.5 人源乳酸菌發酵乳工藝優化

根據Box-Behnken試驗設計原理，本研究在前期單因素實驗的基礎上，以活菌數、pH測定和冷藏后發酵乳狀態為響應值對接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、蔗糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、發酵溫度（33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）與固形物含量（11%、12%、13%、14%、15%）4個因素進行分析。

表1 人源乳酸菌發酵乳配方因素水平表

1.3.6 質構測定

測試模式為compression，測試前下降速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后速度為10.0 mm/s，測試距離為30 mm，采用A/BE探頭，直徑40 mm[10]。

1.3.7 風味物質測定

樣品預處理：固相微萃取法；GC-MS分析色譜條件：色譜柱，PEG-20M柱(30m×0.25mm×0.25I×m)，升溫程序(初始溫度36℃，以4℃/min升至120℃，保持4 min隨后以10℃/min升至230℃，保持8 min載氣(流速0.8 mL/min)，進樣溫度為250℃，

質譜條件：電子能量70 eV，離子化電流200 I×A，離子源溫度200℃，電子倍增電壓350 V[11]。

2 結果與討論

2.1 人源乳酸菌益生特性

對分離得到的人源乳酸菌進行了體外功能益生特性研究，其中獲得了3株益生特性良好且對甘油三酯和膽固醇具有降解作用的乳酸菌株，具體如表2所示。

表2 3株益生特性良好的乳酸菌

2.2 混合菌株發酵特性測定

2.2.1 人源乳酸菌產酸特性

酸度的測定主要監測不同混合乳酸菌的產酸能力及后酸化情況，分別對使用不同人源乳酸菌組別制成發酵乳產酸情況進行測定，結果如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌發酵過程中酸度變化

由圖1發現，L.casei grx12菌株酸度在22 h左右仍有跳躍性增長，L.fermentum grx08酸度隨時間的變化呈現先急速增加后緩慢增長的趨勢，L.rhamnosus LV108、混合乳酸菌（1∶1∶1）和混合乳酸菌（2∶1∶1）酸度均隨測定時間而增加，且在凝乳后緩慢增長。

跟蹤測定3 d后，各組發酵乳酸度發現，混合乳酸菌（2∶1∶1）制備的發酵乳酸度上升3.5 °T，混合乳酸菌（1∶1∶1）制備的酸乳上升4.2 °T，LV108后酸化較弱僅上升2.1°T，L.fermentum grx08和L.casei grx12則分別上升了3.5°T和5.3°T，這可能由于菌株中的脲酶能夠分解尿素形成氮，從而有效減緩后酸化[15]。由此可看出，各組發酵乳的后酸化程度均不高，可作為生產發酵劑使用。

2.2.2 人源乳酸菌產黏特性

對使用不同人源乳酸菌組別制成發酵乳測定其黏度，結果如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌發酵乳發酵過程中黏度變化

選擇產高黏度發酵劑既可提高產品在生產過程中經泵運輸時的抗剪切作用，也可提高產品拉絲感及醇厚的口感。由圖2可看出，不同人源乳酸菌組別發酵劑的黏度隨測定時間的延長先增加后緩慢變化，但最大黏度差異較大，其變化范圍在0.9 Pa·s-1.6 Pa.s。混合乳酸菌（2∶1∶1）發酵劑黏度最高為1.6 Pa·s，grx12黏度則最低為0.9 Pa·s，而grx08、LV108、混合乳酸菌（1∶1∶1）發酵劑的黏度分別為1.5 Pa·s、1.1 Pa·s和1 Pa·s。除grx12外，其它幾組發酵劑黏度均高于1 Pa·s，混合乳酸菌（2∶1∶1）發酵劑黏度高于單一發酵菌株，這主要由于不同菌種間的共生關系能夠刺激菌株的產黏特性[16]。同時，多菌株共同發酵過程中胞外多糖的組分不同，會直接影響酸乳的組織狀態。因此，混合乳酸菌（2∶1∶1）可以優先作為發酵乳發酵劑。

2.2.3 人源乳酸菌蛋白水解能力

對使用不同人源乳酸菌組別制成發酵乳測定游離氨基酸，結果如圖3所示。

圖3 不同乳酸菌發酵過程中氨基酸含量變化

由圖3可以看出，不同人源乳酸菌組別發酵劑的蛋白水解能力差異較大，且隨時間變化呈現先繼續增加后穩定的趨勢，其中grx08游離氨基酸含量最低為1.21 mmol·L-1，而 grx12 含量為 1.35 mmol·L-1，LV108含量為1.13 mmol·L-1。混合乳酸菌（1∶1∶1）發酵劑和混合乳酸菌（2∶1∶1）發酵劑的游離氨基酸含量與單一菌株相差不顯著，分別為1.29和1.43 mmol·L-1，這可能由于混合菌株生長過程中消耗了部分氨基酸[17]。

2.2.4 人源乳酸菌貯藏期內活菌存活率

本研究產品屬于低溫活性發酵乳制品，產品活菌數是考量產品品質的一個重要因素，對使用不同人源乳酸菌組別制成的發酵乳測定3 d和21 d后的產品活菌數值。結果如表3所示。

表3 單一及混合乳酸菌發酵乳貯藏過程中的活菌數變化

由表3可以看出，不同組合發酵劑在活菌數達到最大值后會隨著儲存時間的延長而減少，且呈顯著性差異。其中發酵劑5的活菌總數3 d后仍高達1.10×109CFU/mL，這可能是該發酵溫度下，混合乳酸菌具有良好的共生關系，也可能是某些代謝產物刺激乳酸菌生長繁殖。另外，21 d后發酵劑5的活菌數仍然高達0.78×108CFU/mL，表明混合人源乳酸菌具有較強的穩定性。且該發酵劑制備發酵乳活菌數顯著高于國標GB19302中關于乳酸菌含量要達到1×106CFU/mL的要求。

綜合以上研究發現，混合乳酸菌（2∶1∶1）發酵時間適當、后酸化較弱、黏度較強、游離氨基酸較多且產品活菌數高，混合乳酸菌（2∶1∶1）更適用于人源乳酸菌發酵乳的制備發酵劑。

2.3 人源乳酸菌發酵乳制備條件優化

根據單因素實驗的實驗結果，以混合乳酸菌（2∶1∶1）作為人源乳酸菌發酵乳發酵劑，選擇接種量、發酵溫度、乳固形物含量及蔗糖添加量作為實驗因素，設計正交實驗，并記錄每組乳酸菌發酵乳活菌數量作為評價指標，并用數據分析軟件對正交試驗結果進行直觀和極差分析，結果如表4所示。

表4 混合乳酸菌發酵乳正交實驗結果

由表4可知，發現對混合乳酸菌發酵乳活菌數量影響程度順序依次為A＞C＞D＞B。因此，選定A2B3C2D1，即混合乳酸菌接種量為5.0%，蔗糖添加量為8.0%，發酵溫度為37℃，乳固形物含量為12.0%作為混合乳酸菌發酵乳制備條件。

2.4 人源乳酸菌發酵乳風味和質構特性

2.4.1 人源乳酸菌發酵乳風味物質

以混合乳酸菌（2∶1∶1）作為發酵乳發酵劑，根據最佳工藝制作發酵乳，同時制作普通酸牛奶作為對照，利用頂空SPME GC/MS測定樣品揮發性風味物質，結果如表5所示。

比較普通乳酸菌制備的發酵乳和混合乳酸菌制備的發酵乳中揮發性物質種類可以發現，普通發酵乳中檢測到的揮發性物質種類較少，為26種，而人源乳酸菌制備的發酵乳中檢測到的揮發性物質種類為41株。其中作為發酵乳特征風味物質的乙醛和雙乙酰含量，人源乳酸菌制備的發酵乳的含量分別為25 ug/g和26 ug/g，是普通發酵乳的3倍左右，這就使其特征風味優于普通發酵乳。另外，酸類物質對發酵乳風味強度影響較大，人源乳酸菌制備的發酵乳中己酸、乙酸、辛酸等含量顯著高于普通發酵乳。其中，乙酸具有淡淡的酸味、辛酸具有清香、己酸有油脂味，其它的不飽和脂肪酸具有果香和乳香味[18]。

表5 普通酸奶和混合乳酸菌發酵乳主要揮發性風味物質

2.4.2 多菌株人源乳酸菌發酵乳質構特性

表6 普通酸奶和混合乳酸菌發酵乳質構特性

由表6可知，多菌株人源乳酸菌酸奶的質構特性顯著優于空白組，其硬度、稠度、凝聚性和黏度分別為215 g、5179 g·s、178 g、341 g·s。這主要是因為多菌株人源乳酸菌酸奶組織狀態細膩、均勻，且硬度、稠度、凝聚性和黏度都較適中，這也是容易被消費者接受的原因。

3 結論

混合乳酸菌（L rhamnosus LV108∶L.casei grx12∶L.fermentum grx08=2∶1∶1）發酵時間適當、后酸化較弱、黏度較強、游離氨基酸較多且產品活菌數高，以混合乳酸菌（2∶1∶1）為發酵劑的最佳發酵工藝為接種量為5.0%，蔗糖添加量為8.0%，發酵溫度為37℃，乳固形物含量為12.0%。按此參數生產的多菌株人源益生菌酸奶組織細膩、質地均勻、酸甜適中、黏稠適度，具有較佳的風味。