高分辨質(zhì)譜快速篩查牛乳中10種禁用獸藥殘留

貢松松，張婧，嚴(yán)鳳，吳劍平，潘娟，盧洪秀

（1.上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103；2.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物與生態(tài)技術(shù)系，上海201600）

0 引 言

由于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中獸藥的大規(guī)模使用，牛乳中抗生素和激素的殘留受到廣泛關(guān)注。歐盟對(duì)獸藥殘留限量作了嚴(yán)格規(guī)定[1]。我國(guó)為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控，也對(duì)此作了嚴(yán)格規(guī)定[2]。有研究表明，兒童性早熟，男性前列腺癌，婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與食品中雌激素（Estrogens）的殘留有關(guān)[3-5]。氯霉素類(Chloramphenicols)藥物通過食物鏈進(jìn)入人體，則會(huì)對(duì)人體造血機(jī)能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[6-7]。

牛乳中雌激素和氯霉素常用的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[9-10]。GC-MS雖然分離效果好，但是雌激素需要衍生化，操作繁瑣。以四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜既可以獲得分子離子信息，又能獲得豐富的碎片離子信息。因此，其成為多殘留的有效分析方法[11-12]。本文借鑒QuEChERS[13-16]方法在多殘留前處理方面的優(yōu)勢(shì)，建立了生鮮牛乳中10種禁用獸藥的快速篩查方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純），甲酸（色譜純），乙酸（分析純），無水硫酸鈉，氯化鈉（分析純），乙二胺-N-丙基硅烷（PSA），十八烷基硅烷（ODS C18），超濾離心管（3ku），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Chloroamphenicol,CAP)，甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Thiamphenicol,TAP)，氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(Florfenicol,FF)，雌酮標(biāo)準(zhǔn)品(Estrone,E1)，己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(Hexestrol,HES)，炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)品(Ethinylestradiol,EE2)，雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品(Estriol,E3)，己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(Diethylstilbestrol,DES)，雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品(Estradiol,E2)，雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(Dienestrol,DIE)，純度均大于96.1%。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（6530），包括G4220A流動(dòng)相輸送泵，G4226A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316C柱溫箱，G4212A二極管陣列檢測(cè)器；Mass-Hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，AE240電子天平，Allegra X-22R高速冷凍離心機(jī)，多管漩渦振蕩器，Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品貯備液：稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品（根據(jù)純度折算質(zhì)量），用色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的單標(biāo)貯備液。對(duì)于每類化合物，將單標(biāo)溶液混合制成50或質(zhì)量濃度為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)再根據(jù)需要混合或稀釋，這些混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用來制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)量控制樣品。將配制好的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液置于4℃環(huán)境下低溫避光保存。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋震蕩4 min，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取10 mL上層清液于離心管中，加入1.0 g無水硫酸鈉，0.2 g PSA，渦旋振蕩器振蕩4 min，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于40℃氮?dú)獯抵两桑?.0 mL乙腈-水溶液（5∶95，體積比）定容，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0 min，5%B；2 min，5%B，2～4 min，5%～40%B；4～9 min，40%～80%B；9～9.5 min，80%～95%B；9.5～15 min，95%～95%B；15～17 min，95%～5%B；17～20 min，5%B；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源為Dual AJS ESI，負(fù)離子模式；掃描范圍為50～1000 m/z；干燥氣溫度為320℃；干燥氣流速為8 L/min；霧化器壓力為0.24 MPa；鞘氣溫度為400℃；鞘氣流速為12 L/min；毛細(xì)管電壓為3 000 V；噴嘴電壓為500 V；碎裂電壓為130 V；飛行時(shí)間管真空度為2.04×10-7；儀器在高分辨率（4 GHz），低質(zhì)量范圍（＜m/z 1700）下操作。10種雌激素類和氯霉素類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)和提取離子色譜圖分別如表1所示。

1.6 篩查譜庫(kù)的建立

取合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液稀釋到質(zhì)量濃度為1 mg/L，在優(yōu)化好的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)藥物的保留時(shí)間、質(zhì)子化的分子質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量誤差等信息。在不同的碰撞電壓下再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)化合物的二級(jí)全掃描圖及質(zhì)譜碎片信息，以此建立10種雌激素類和氯霉素類藥物的篩查譜庫(kù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了SB C18（3.0 mm ×100 mm，1.8 μ m）、SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）和Extend C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）3種色譜柱對(duì)10種雌激素類和氯霉素類藥物的分離度和檢測(cè)靈敏度的不同影響。實(shí)驗(yàn)表明，ZORBAX SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱更適合分析目標(biāo)藥物，內(nèi)徑越小，峰形越尖銳對(duì)稱。雖然5 cm色譜柱用時(shí)更短，但不能保證每種藥物都有良好的峰形，在粒徑相同的情況下，采用內(nèi)徑更小的10 cm色譜柱，結(jié)合高分辨質(zhì)譜的優(yōu)異性能，能獲得良好的分離度。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察不同pH的水系流動(dòng)相（水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液）對(duì)目標(biāo)藥物在色譜柱上分離效果的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相加入甲酸或乙酸后，峰形較差。當(dāng)使用超純水時(shí)，目標(biāo)藥物的離子化效率較好，分離效果令人滿意。故選擇乙腈和水作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫方式可以很好地將10種雌激素類和氯霉素類藥物分離，具有較好的靈敏度和分辨率。

2.1.3 梯度洗脫條件的選擇

由于10種雌激素類和氯霉素類的極性差異較大，采用恒定的流動(dòng)相很難將各個(gè)藥物分開，故采用梯度洗脫的方式，改變流動(dòng)相的極性，從而達(dá)到使目標(biāo)藥物完全分開的目的。實(shí)驗(yàn)比較了不同比例的初始流動(dòng)相中的有機(jī)相（5%，10%，20%）和不同的洗脫時(shí)間（12，15，20 min）對(duì)洗脫效果的影響。隨著乙腈比例的升高，多數(shù)藥物被快速的洗脫下來，沒有達(dá)到良好的分離，當(dāng)乙腈的初始比例為5%時(shí)，目標(biāo)藥物能被緩慢地洗脫下來，分離良好。隨著洗脫時(shí)間的增加，全部藥物能有較好的靈敏度和分辨率。故選擇初始流動(dòng)相有機(jī)相比例為5%，洗脫時(shí)間20 min。

2.1.4 定容液的選擇

表1 10種雌激素類和氯霉素類藥物信息

樣品定容液不僅會(huì)影響目標(biāo)藥物的分離效果，而且還會(huì)影響離子化效率。本實(shí)驗(yàn)比較了超純水、乙腈-水（5∶95，體積比）、乙腈-水（20∶80，體積比）、乙腈-水（50∶50，體積比）和乙腈-水（90∶10，體積比）作為定容液時(shí)的情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)定容液有機(jī)相比例超過初始流動(dòng)相中的有機(jī)相比例時(shí)，多數(shù)藥物的峰形變寬。當(dāng)有機(jī)相比例不大于初始流動(dòng)相時(shí)，峰形較尖銳，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水（5∶95，體積比）作為定容液，跟初始流動(dòng)相比例相同。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Dual AJS ESI容負(fù)離子模式下，在50～1 000 m/z范圍內(nèi)作一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到10種雌激素類和氯霉素類藥物的總離子色譜圖。比較各個(gè)化合物的提取離子色譜圖的響應(yīng)和峰形，依次優(yōu)化鞘氣溫度和流速、噴嘴電壓、毛細(xì)管電壓、霧化器壓力和干燥氣溫度和流速。然后優(yōu)化不同的碎裂電壓，在定性分析軟件中，選擇最優(yōu)電壓參數(shù)。詳細(xì)參數(shù)見1.5.2。

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1 超濾膜方法的優(yōu)化

稱取5.0 g牛乳樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩30 s，轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液于40℃氮?dú)獯抵两桑?.0 mL乙腈-水溶液（5∶95，體積比）定容，轉(zhuǎn)移至3 ku的超濾離心管中，14 000 r/min離心60 min，凈化過后的提取液用于進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)比較了未經(jīng)初始流動(dòng)相溶液潤(rùn)洗超濾膜（A組）和經(jīng)初始流動(dòng)相溶液潤(rùn)洗（B組）對(duì)超濾離心管凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，預(yù)洗步驟對(duì)目標(biāo)藥物的回收率沒有產(chǎn)生明顯影響。另外，雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的回收率均低于50%。

圖1 預(yù)洗對(duì)10種雌激素類和氯霉素類藥物回收率的影響

2.3.2 QuEChERS提取溶劑的優(yōu)化

為了同時(shí)提取10種雌激素類和氯霉素類藥物，實(shí)驗(yàn)比較了不同酸度的乙腈作為提取液，分別為：乙腈（A）、0.1%甲酸乙腈（B）、1%甲酸乙腈（C）、0.1%乙酸乙腈（D）、1%乙酸乙腈（E）。10種雌激素類和氯霉素類藥物的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出：B，C，D，E組的雙烯雌酚和己烷雌酚回收率不足20%；C，D，E組的己烯雌酚已檢測(cè)不出；A組藥物總體回收率介于50%～120%之間，故選擇A組（乙腈）作為提取溶劑。

2.3.3 QuEChERS凈化步驟的優(yōu)化

傳統(tǒng)的QuEChERS方法使用PSA作為吸附劑去除果蔬中脂肪酸色素等物質(zhì)，而牛乳基質(zhì)更為復(fù)雜，含有大量的脂肪和蛋白，脂肪和蛋白質(zhì)的干擾對(duì)牛乳樣品至關(guān)重要。PSA是在高純硅膠基質(zhì)上鍵合N-丙基乙二胺的極性吸附劑。C18是一種非極性吸附劑，可吸附非極性到中等級(jí)性的化合物。PSA和C18都可用于除去脂肪酸、色素和糖類等基質(zhì)成分，這些分散固相萃取劑在凈化樣品的同時(shí)有可能對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生一定的吸附作用，因此有必要對(duì)PSA（A組）和C18（B組）進(jìn)行優(yōu)化。以藥物的回收率作為評(píng)定依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出：B組己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚回收率不足30%，與B組數(shù)據(jù)相比，A組數(shù)據(jù)回收率介于50%～120%之間，故優(yōu)化條件選擇A組（PSA）作為吸附劑。

2.3.4 超濾膜與QuEChERS方法的比較

從圖1和圖3可以發(fā)現(xiàn)，超濾膜雖然能夠節(jié)省時(shí)間，簡(jiǎn)化步驟，但是有超過50%的藥物回收率低于50%。QuEChERS方法藥物回收率介于50%和120%之間，適用于藥物多殘留分析，故采用QuEChERS方法。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

圖2 提取溶劑對(duì)10種雌激素類和氯霉素類藥物回收率的影響

圖3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法的弊端之一是基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象，因此有必要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。取空白生鮮牛乳樣品基質(zhì)溶液與流動(dòng)相分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以分子離子峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X（μg·L-1）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得目標(biāo)化合物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用公式ME=k1/k2×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（見表2）。其中k1和k2分別為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。ME偏離100%越多，說明基質(zhì)效應(yīng)越明顯。如表2所示，氟苯尼考和雌三醇出現(xiàn)了

基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚出現(xiàn)較強(qiáng)的基質(zhì)抑制，其余的化合物基質(zhì)效應(yīng)不明顯。因此本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。10種雌激素類和氯霉素類的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)如表2所示。

2.4.2 檢出限（LOD）與定量限（LOQ）

用空白牛乳基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，以3倍儀器檢測(cè)信噪比（S/N=3）計(jì)算各化合物的定性篩查檢出限（LOD），結(jié)果表明，10種雌激素類和氯霉素類的LOD為5～20 μg/kg。以10倍信噪比（S/N=10）估算定量下限，10種雌激素類和氯霉素類的LOQ為10～50 μg/kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

2.4.3 回收率與精密度

采用空白生鮮牛乳樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)，樣品分別添加低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，10種雌激素類和氯霉素藥物的回收率為61.2%～116.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～10.8%。

2.5 實(shí)際樣品的篩查

應(yīng)用本方法對(duì)全國(guó)8個(gè)省市的80份牛乳樣品，采用已建立的超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查方法，再經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜確證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雌酮和雌三醇均表現(xiàn)出一定的個(gè)體差異性，雌酮的平均值為132.0 μg/kg，最大值達(dá)到了393.9 μg/kg。雌三醇的均值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.0 μg/kg，最大值達(dá)到了92.5 μg/kg。

表2 10種雌激素類和氯霉素類藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表3 10種雌激素類和氯霉素類藥物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

雌三醇、雌酮為天然激素，可能為奶牛體內(nèi)的內(nèi)源性激素。作為一種篩查方法，適用于生鮮牛乳中雌激素類和氯霉素類藥物的快速定性確證，可為監(jiān)管和監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)。

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜的快速分析與飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨率優(yōu)勢(shì)，建立了生鮮牛乳中10種雌激素類和氯霉素類藥物的超高效液相色譜—四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜篩查與確證方法，改進(jìn)了前處理方法，優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件。本方法快速簡(jiǎn)便，前處理成本低廉。作為一種篩查方法，適用于生鮮牛乳中10種雌激素類和氯霉素類藥物的快速定性確證。