乳蛋白呈味肽的酶解工藝優(yōu)化

李心芯

（江蘇旅游職業(yè)學(xué)院，江蘇揚州，225000）

0 引 言

乳品香精憑借其獨特的口感，一直廣受消費者的青睞。隨著生活水平的提高，化學(xué)合成的奶味香精已經(jīng)難以滿足消費者對健康和營養(yǎng)的需求，天然奶味香精成為市場的新導(dǎo)向。研究發(fā)現(xiàn)，通過酶解乳脂得到的脂肪酸具有奶制品獨特的奶香風(fēng)味，是制備天然奶味香精的有效途徑[1]。而國內(nèi)對分離乳脂后剩余的乳蛋白的應(yīng)用研究，尤其是呈味方面的研究尚處于起步階段，目前的報道涉及牡蠣[2]、牛骨[3]、鱈魚[4]、大豆[5]等。本研究利用蛋白酶將分離乳脂后剩余的乳蛋白進行水解，得到兼具營養(yǎng)和呈味功能的多肽和氨基酸，并對其酶解工藝進行優(yōu)化，為制取乳味足、滋味好的天然乳品香精提供基礎(chǔ)，有較廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

新西蘭奶油，食品級，上海愛普香精香料有限公司；中性蛋白酶Neutrase，食品級，諾維信中國投資有限公司，簡稱N酶；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme，食品級，諾維信中國投資有限公司，簡稱F酶，其他試劑均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，XW-80A旋渦混合器，722型分光光度計，90-2型定時恒溫磁力攪拌器，GL-20B型冷凍離心機，LGJ－10冷凍干燥機，Delta 320 pH計，自制酶反應(yīng)器、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 奶油分離蛋白的制備

在50℃下將新西蘭奶油融化，離心去除上層乳脂，剩余溶液用LGJ－10冷凍干燥機冷凍干燥后，得到奶油分離蛋白凍干粉，簡稱奶油分離蛋白。

1.2.2 原料基本成分分析方法

脂肪含量的測定：堿水解法GB5413.3-2016；蛋白的測定：凱氏定氮法GB5009.5-2016；水分的測定：干燥法GB5009.3-2016；灰分的測定：灼燒重量法GB5009.4-2016；乳糖的測定：高效液相色譜法GB5009.8-2016。

1.2.3 蛋白酶的選擇

加入pH 7.0磷酸緩沖液，控制底物濃度2.5%，恒溫50℃下反應(yīng)4 h后，對酶解產(chǎn)物的滋味進行感官評價，初步篩選出本實驗適用的酶種。

1.2.4 酶解工藝的技術(shù)路線

在自制酶反應(yīng)器中加入適量底物及緩沖液，并將其置入恒溫水浴中，固定攪拌速度，設(shè)定反應(yīng)體系初始pH及反應(yīng)溫度，加入酶進行反應(yīng)，并允許在酶反應(yīng)過程中pH自然下降[6]。恒溫反應(yīng)一定時間后，85℃滅酶10 min，待反應(yīng)物冷卻后取部分酶解產(chǎn)物測定其總氮含量和12%TCA-N，其余濃縮并凍干后進行感官評定。

1.2.5 蛋白酶解的工藝指標(biāo)

1.2.5.1 12%三氯乙酸-可溶性氮（12%TCA-N）的測定

方法：移取2.5 mL反應(yīng)液，加入25 mL質(zhì)量濃度12%的三氯乙酸（TCA）溶液，用20 mL緩沖液進行充分沖洗，將所得懸浮液離心20 min（4 000 r/min），取一定量上清液移入凱氏消化瓶中，進行凱氏微量定氮。

三氯乙酸是一種常用的蛋白質(zhì)沉淀劑，所以12%TCA-N中的主要成分是小分子肽以及游離氨基酸。12%TCA-N的高低能反映蛋白酶對底物水解的程度[7]。

1.2.5.2 蛋白酶水解過程中生成肽占總氮的百分含量

肽百分含量：水解過程中生成的肽占總氮的百分含量。其計算公式如下：

TCA-N:肽百分含量；0hTCA-N:酶解反應(yīng)前反應(yīng)物中總肽的含量（mg/mL）；12hTCA-N:酶解反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物中總肽的含量（mg/mL）;總N：反應(yīng)物中的總氮含量（mg/mL）。

1.2.5.3 感官評價

本實驗采用國家標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)味剖面檢驗法（GB 12313-1990）,對酶解產(chǎn)物的滋味進行感官評價。感官評價小組由13名年齡在21-25歲、經(jīng)過培訓(xùn)的感官評價員組成，男女分別為6、7人。評分采用5分制（0表示沒有，5表示強烈），對酶解產(chǎn)物的滋味（包括奶味、鮮味、酸味和苦味）進行評價。滋味評價首先確定在既定的酶解時間下酶解產(chǎn)物最佳稀釋度，本次選取將水解產(chǎn)物冷凍干燥后稱取適量，添加入0.025 g/mL的糖水溶液。進行感官評價時樣品溫度保持在40℃，13名感官評價員根據(jù)不同蛋白酶解液的整體滋味進行評價，每一樣品的每個特性取評分的均值作為感官評價的結(jié)果，然后進行排序。

1.2.6 單因素實驗

以奶油分離蛋白作為蛋白酶反應(yīng)的底物，對其反應(yīng)條件進行單因素實驗，選擇TCA-N%為蛋白水解反應(yīng)水解度參數(shù)，對反應(yīng)的底物濃度、溫度和初始pH三個因素進行探索。

1.2.7 酶解產(chǎn)物的感官評定

1.2.7.1 酶解底物的稀釋倍數(shù)

選擇12 h酶解產(chǎn)物，兩種酶解產(chǎn)物均按2%、2.5%、3%、3.5%、4%的比例添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中進行評定。

1.2.7.2 選擇酶解產(chǎn)物滋味最佳的水解時間

感官評價員根據(jù)對酶解產(chǎn)物的感官評價（酸味、苦味、奶味、鮮味，每項最低1分，最高5分）和喜好程度（最低1分，最高9分）進行評分，分值越高相應(yīng)滋味的強度越大，計算各項平均分值為最終結(jié)果。

1.2.8 響應(yīng)面實驗

根據(jù)底物二次篩選的結(jié)果，選取適當(dāng)因素，每個因素選取三個水平，進行響應(yīng)面實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 奶油分離蛋白的主要成分

如表1所示，奶油分離蛋白的主要成分是蛋白質(zhì)，含量占近四分之三。脂肪含量約為7.5%，這些未徹底分離的脂肪可能是由緊密吸附在脂肪球膜蛋白表面的少量乳脂肪隨球膜蛋白一起被分離而引入的[8]。此外，其還含有少量的乳糖、水分和灰分。

表1 底物的主要成分分析結(jié)果

2.2 蛋白酶的選擇

目前市場上酶制劑種類繁多，但大部分水解過程中易生成苦味物質(zhì)，因而本研究選用酶解制備香精香料中最常用的F酶和N酶進行研究[9]。N酶作為內(nèi)切酶，單獨使用時水解蛋白的能力較強，易水解過度生成苦味肽，進而影響酶解產(chǎn)物的感官品質(zhì)[10]。F酶同時具有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種酶活力，能較好的增進和改善食品的風(fēng)味，但其活力較低，單獨使用時總氮回收率不高，為克服其缺點，與N酶聯(lián)合使用，以達到較高的水解程度并得到良好風(fēng)味的產(chǎn)品[11]。

結(jié)果顯示（表2），單獨使用N酶，酶解產(chǎn)物有明顯的苦味，而單獨使用F酶時，酶解產(chǎn)物的滋味顯著增強。為了獲得更高的產(chǎn)量，聯(lián)合使用N酶和F酶對乳制品進行酶解，則在滋味增強的同時消除了苦味[12]。

表2 酶解產(chǎn)物感官評定結(jié)果

2.3 單因素實驗

2.3.1 底物濃度對TCA-N%的影響

選定 4個底物濃度（0.02 g/mL、0.028 g/mL、0.036 g/mL、0.044 g/mL），觀察不同的底物濃度對酶解后TCA-N%的影響（圖1）。當(dāng)奶油分離蛋白底物濃度由0.02 g/mL升高到0.028 g/mL時，TCA-N%升高較快，并在底物濃度0.028 g/mL時達到最高值，繼續(xù)加大底物濃度，TCA-N%并沒有隨之升高，而是相對穩(wěn)定。

底物濃度會直接影響酶解過程中蛋白酶的濃度，進而影響反應(yīng)的進行程度。如果底物濃度偏高，就會導(dǎo)致蛋白酶濃度偏低，不能水解生成足量的滋味物質(zhì)；反之，則會導(dǎo)致蛋白酶濃度過高，進而使整個酶解過程速度過快不便控制，易生成苦味肽影響酶解產(chǎn)物的滋味。通過圖1可以看出，實驗最佳底物濃度為0.028 g/mL。

圖1 底物濃度對TCA-N%的影響

2.3.2 溫度對TCA-N%的影響

選定5個溫度水平40、45、50、55、60 ℃，觀察不同溫度下對酶解產(chǎn)物TCA-N%水平的影響（圖2）。當(dāng)溫度從40℃上升到45℃時，奶油分離蛋白的酶解產(chǎn)物TCA-N%呈快速上升趨勢，并在45℃時達到最高值，此時隨著溫度繼續(xù)升高，酶解產(chǎn)物TCA-N%呈現(xiàn)下降趨勢。

溫度會影響酶催化反應(yīng)的反應(yīng)速度以及酶的穩(wěn)定性，不同的酶有不同的最適反應(yīng)溫度范圍，過高或過低都會對酶解過程產(chǎn)生不利影響。尤其是溫度高于55℃以后，水解度明顯下降。通過圖2可以看出，實驗最佳酶解溫度為45℃。

圖2 溫度對TCA-N%的影響

2.3.3 初始pH對TCA-N%的影響

選定五個不同水平（初始pH 5、6、7、8、9），觀察不同pH條件下，酶解產(chǎn)物TCA-N%的情況（圖3）。奶油分離蛋白的酶解產(chǎn)物其TCA-N%有兩個不同的階段，首先當(dāng)pH從5升至6時，TCA-N%快速增加，而在pH6升至7的過程中，TCA-N%基本保持穩(wěn)定，當(dāng)pH進一步升高，由7到8時，TCA-N%快速增加并達到最大值。當(dāng)pH由8至9時，酶解產(chǎn)物濃度呈快速下降趨勢。

酶解初始pH不僅會影響酶催化反應(yīng)中酶的穩(wěn)定性，還會影響酶與底物的結(jié)合，以及反應(yīng)進行的程度，因而pH值過高或過低都不利于酶解反應(yīng)的進行。從圖2-圖3可以看出，初始pH對酶解進程的影響要大于其他因素，且在初始pH 8時酶解效果最好,TCA-N%最高，因此本實驗選擇反應(yīng)初始pH為8。

2.4 酶解產(chǎn)物的感官評定[13]

圖3 初始pH對TCA-N%的影響

根據(jù)上述單因素實驗的結(jié)果，在N酶添加量2%，F(xiàn)酶添加量6%的基礎(chǔ)上，選擇初始pH 8，反應(yīng)溫度45℃，底物濃度0.028 g/mL，分別取奶油分離蛋白和濃味切達奶酪反應(yīng)12 h的酶解產(chǎn)物，再按2%、2.5%、3%、3.5%、4%的比例添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中進行初步的感官評價，選擇適宜進行感官評價的酶解產(chǎn)物比例。結(jié)果（表3）顯示，2%的奶油分離蛋白的酶解產(chǎn)物口味偏淡，但大于3%時口味又過于濃郁；在酶解產(chǎn)物為2.5%時既有明顯的滋味，又沒有厚重感。因此選擇2.5%的酶解產(chǎn)物進行感官評價。

表3 選擇產(chǎn)物適合稀釋倍數(shù)的感官評定結(jié)果

為觀察奶油分離蛋白經(jīng)過不同酶解時間后的滋味變化，根據(jù)上述感官評價結(jié)果，分別取酶解進行8、10、12和14 h的產(chǎn)物，選擇2.5%奶油分離蛋白酶解產(chǎn)物添加到0.025 g/mL的蔗糖水溶液中進行全面的感官評價。13名感官評論員對酶解產(chǎn)物的滋味（包括酸味、苦味、奶味和鮮味）進行評分，評分采用5分制（0表示沒有，5表示強烈）。評分結(jié)果見表4。

表4 選擇產(chǎn)物產(chǎn)生最佳牛奶滋味的水解時間的感官評定結(jié)果

感官評價結(jié)果（表4）顯示，奶油分離蛋白12 h的酶解產(chǎn)物奶味和鮮味最高，14 h的酶解產(chǎn)物苦味最高。因此，選擇奶油分離蛋白的12 h酶解產(chǎn)物樣品做進一步的感官評價。

取奶油分離蛋白12 h的酶解產(chǎn)物的凍干品進行接受性感官評價。由13名感官評論員采用9點快感標(biāo)度法進行打分(非常喜歡、很喜歡、喜歡、稍喜歡、一般喜歡、稍不喜歡、不喜歡、很不喜歡、非常不喜歡)，取平均分值進行分析，滿分為9分，分值越高說明接受度越大。試驗結(jié)果如表5所示。奶油分離蛋白12 h酶解產(chǎn)物的接受度為6.9，在具體口味描述上，感官評價員認(rèn)為：奶味足，無苦味，但稍有酸味。

表5 奶油分離蛋白12 h酶解產(chǎn)物凍干品感官評定

2.5 酶解工藝參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

為進一步優(yōu)化奶油分離蛋白酶解參數(shù)，基于上述單因素實驗的結(jié)果，在底物濃度為0.028 g/mL，加酶量不變的條件下對奶油分離蛋白的水解采用響應(yīng)面設(shè)計的中心組合實驗Box-Behnken設(shè)計方案[14]。以感官評價（綜合奶味0～5分、鮮味0～5分、酸味0～-5分和苦味0～-5分，最高10分，最低0分）為指標(biāo)，選擇能夠顯著影響酶解產(chǎn)物理化和感官特性的三個因素：酶解時間（A）、初始pH（B）以及酶解溫度（C）為參考因素，分別以低、中、高三個水平對自變量進行編碼（表6），實驗設(shè)計方案和實驗結(jié)果見表7。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計實驗因素與水平

表7 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果分析

根據(jù)試驗表實施后，需要對實驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，然后得到交互項和平方項的二次方程Y=β0+∑βiXi+∑βijXiXj+∑βiiXi2。其中Y是預(yù)測響應(yīng)值，本研究中為感官評價值；X是自變量，本研究中為酶解時間、酶解pH和酶解溫度，β為待估計參數(shù)值。

采用Design-Expert 7.1.3軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進行線性擬合方差分析，考查因素顯著性，根據(jù)回歸方程，響應(yīng)面曲線、高等線圖，分析各個因素交互作用的顯著性，其實驗結(jié)果如下：通過分析表7，各因素與感官評價指標(biāo)的二次多項式模型方差分析結(jié)果見表8。主模型F值為2.87，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（p=0.0157）。模型的確定系數(shù)值為0.8803，說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系明顯，模型能很好的解釋88.0%響應(yīng)值的變化，該模型擬合度較好。模型的變異系數(shù)值為16.0%，說明模型的精密度不是很好，可能是因為感官評價指標(biāo)主觀性較大，而感官評價員人數(shù)較少（13人）導(dǎo)致數(shù)據(jù)的變異較大所致。后續(xù)研究中需要用客觀指標(biāo)如12%TCA-N結(jié)合感官評價指標(biāo)進行綜合評定。本研究模型的信噪比Adeq Precision的值較高（6.60），即可以利用該回歸模型代替實驗真實點對酶解產(chǎn)物進行分析和預(yù)測。但由于Pred R-Squared值與Adj R-Squared值相差較大，也表明該響應(yīng)面方程需要做進一步的優(yōu)化。綜上所述，該模型在一定程度上說明各因素水平區(qū)間設(shè)計比較合理，能夠在一定程度上反映酶解產(chǎn)物感官值與酶解時間、酶解pH以及酶解溫度之間的關(guān)系。

回歸模型各項的方差分析結(jié)果表明，A2，B2，C2項均為顯著項，B項也近似顯著。利用旋轉(zhuǎn)實驗設(shè)計軟件得到回歸方程如下：

感官評價值=6.12-0.096A+0.57B+0.25C+0.23AB+0.63AC-0.10BC-1.28A2-1.41B2-0.91C2

該方程表達酶解產(chǎn)物的感官評定值與酶解時間、酶解溫度和酶解pH因素之間的變化規(guī)律。

表8 響應(yīng)面二次模型方差分析

圖4至圖6則分別表示了酶解作用時間，酶解初始pH和酶解溫度對酶解產(chǎn)物感官評價結(jié)果的影響。

利用軟件對響應(yīng)面結(jié)果進行最優(yōu)化分析，確定在底物濃度為0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F(xiàn)酶的添加量為6%的前提下，酶解作用時間為12.04 h，初始pH 8.2和酶解溫度為45.66℃條件下感官評價結(jié)果為6.19。表明該模型可為復(fù)合蛋白酶水解乳蛋白生成呈味肽的水解工藝提供指導(dǎo)。

2.6 最佳酶解條件驗證試驗

由于實驗室設(shè)備條件限制，設(shè)置最佳酶解條件為底物濃度為0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F(xiàn)酶的添加量為6%，酶解溫度46℃、初始pH8、酶解時間12 h，進行驗證試驗。

對驗證試驗中的乳蛋白酶解產(chǎn)物進行感官評價，13名感官評論員采用9點快感標(biāo)度法，對酶解產(chǎn)物進行打分，結(jié)果為7.08±0.76；具體口味描述上，評價員一致認(rèn)為該奶油分離蛋白的酶解產(chǎn)物奶味足，無苦味，與預(yù)測試驗結(jié)果一致。

圖4 45℃時酶解作用時間和酶解pH的交互作用對酶解產(chǎn)物感官評價的影響。

圖5 pH8時酶解時間和酶解溫度的交互作用對酶解產(chǎn)物感官評價的影響。

3 結(jié) 論

圖6 酶解時間12 h，酶解溫度和酶解pH的交互作用對酶解產(chǎn)物感官評價的影響。

試驗首先通過單因素試驗研究了底物濃度、酶解溫度、酶解初始pH值對酶解產(chǎn)物三氯乙酸-可溶性氮含量（TCA-N%）的影響，確定在N酶的添加量2%，F(xiàn)酶的添加量為6%的條件下，奶油分離蛋白的單因素最佳水解條件為：初始pH 8，溫度45℃，底物濃度0.028 g/mL。并以感官評定為指標(biāo)，進一步通過響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，確定在底物濃度0.028 g/mL，N酶的添加量2%，F(xiàn)酶的添加量為6%的前提下，最佳酶解條件為溫度45.66℃，pH 8.2，反應(yīng)時間12.04 h。此時的酶解產(chǎn)物奶味較足，無苦味。