腐敗干酪中微生物種類的分離與鑒定

楊攀，黃麗，唐艷，馮玲，農皓如，李玲，曾慶坤

（中國農業科學院廣西水牛研究所南寧530001）

0 引 言

南方水牛乳主產區氣候相對濕熱，而水牛飼養模式以規模化與散戶并存，機械擠奶與手工擠奶并存，生乳菌落總數偏高，加上干酪生產需要將殺菌溫度控制在較低水平。這些因素均不利于產品加工、成熟、貯藏過程中的微生物控制，造成廣西區內企業生產的干酪極易發生霉菌、酵母污染。加上成熟干酪需長時間在低溫下進行成熟，生產周期長，增加了微生物控制難度，同時也增加了企業前期冷藏存貯設備投入。

霉菌和酵母幾乎在任何食品上都可以生長：谷物、水果、蔬菜、堅果、乳制品等[1]。Filtenborg等認為與各食品霉變相關的霉菌只有少量幾種，大部分屬于青霉、曲霉和鐮刀霉。不同的青霉菌會在不同食品冷態儲存中出現，P.roqueforti和P.commune經常會導致硬質干酪的腐敗[2]。近平滑假絲酵母、黏紅酵母、克魯維酵母漢遜(氏)德巴利酵母菌是酸奶和其他發酵乳制品中主要的腐敗菌[3]。

微生物分離和純化主要指的是在相應技術條件輔助下，從高度混雜、種類眾多的細菌群中獲取單一菌落的過程。其通過對目標菌株適宜培養條件、培養基進行優化和選擇來實現分離、純化的目的[4]。

隨著科學技術的進步，微生物的分析手段也日趨完善，特別是以DNA為基礎的分子生物學技術取得較大進展，并廣泛應用到食品微生物領域，如實時定量熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術[5]、變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）[6-7]、末端限制性片段長度多態性分析技術（TRFLP）[8-9]等。近幾年來，高通量測序技術快速發展，代表性的測序平臺包括Illumina、Roche、Ion Torrent等[10]，為微生物群落分析提供了新的手段。高通量測序技術可以檢測到樣本中傳統純培養不能發現的低豐度細菌種類，從而更加準確、全面地反映樣本中的微生物群落結構[11]。

本實驗主要是通過傳統培養法和高通量測序法研究腐敗干酪中微生物的種類和分布情況，為篩選抑制干酪腐敗的乳酸菌做基礎，對采用天然的防腐劑延長干酪貨架期具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐敗干酪，孟加拉紅培養基（虎紅瓊脂），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），乳酸酚棉藍染色液，DNA提取試劑盒，rTaq DNA Polymerase，BSA，Buffer，dNTPS，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，Tris-HCl，PCR儀：ABI GeneAmp?9700型，小型離心機，電泳儀，恒溫水浴鍋，QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

隨機抽取霉變干酪，根據不同的霉變顏色分為2組樣品，每組樣品包含3個樣，分別稱取霉變干酪2 g放入18 mL無菌水中浸泡15 min，隨后不斷研磨震蕩至樣品均勻分散，備用。

選取霉變干酪的表面霉變部分和內部未霉變部分，分別命名為MGL1、MGL2、MGL3、YGL1、YGL2、YGL3，將樣品送至上海美吉生物有限公司進行高通量測序。

1.2.2 微生物的分離與純化

在無菌操作臺中，吸取0.5 mL的樣品，置于4.5 mL的無菌水中，以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋。依次做6個稀釋度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，吸取100 μL稀釋度為 10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液分別均勻的涂布于孟加拉紅培養基和PDA培養基中，同時用無菌水做平行實驗。稍后將平板倒置，在28℃±1℃培養箱中培養3-5天，觀察并記錄[12]。

根據菌落形態進行分類，用接種針挑取形態學特征不同的菌落，在孟加拉紅培養基和PDA培養基進行劃線分離，從無明顯雜菌開始，28℃±1℃連續培養三代，直至得到單個菌落純化菌種。

1.2.3 微生物的鑒定與保存

觀察菌落在固體培養基上的特征，包括菌落生長速度、大小、形態構造、顏色、質地、高度、表面特征、背面特征、邊緣特征以及培養基的顏色變化、氣味等。

觀察顯微鏡下菌體的形態。在干凈的載玻片上加一滴乳酸酚棉藍染色液，用接種針從菌落的邊緣處取帶有孢子的菌絲，放入乳酸酚棉藍染色液中，再小心地把菌絲散開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產氣，先低倍鏡檢，必要時再換高倍鏡觀察。

通過鏡檢確保菌株一致，用接種針挑取單個菌落，保存菌種于PDA斜面上，于4℃冷藏保存。

1.2.4 總DNA提取方法

使用FastDNA?RSPIN Kit for Soil試劑盒抽提基因組DNA，具體步驟按照說明書進行。

1.2.5 PCR擴增18S rDNA基因序列

擴增18S rDNA基因引物為真菌通用引物，如表1所示。

表1 PCR擴增引物

將上述提取的DNA作為擴增模板，采用20 μL反應體系進行PCR擴增，條件如表2所示，PCR循環參數如表3所示。

1.2.6 樣品復雜度分析

采用稀釋曲線和菌種豐富度指數（Chao1）、辛普森指數（Simpson）、香農指數（Shannon）等系列統計學分析指數評估樣本中微生物群落的物種豐富度和多樣性。

表2 PCR擴增體系

表3 PCR循環參數

1.2.7 物種注釋與評估

為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法，對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平，即：domain（域），kingdom（界），phylum（門），class（綱），order（目），family（科），genus（屬），species（種）統計各樣本的群落組成。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定

本實驗通過嚴格的實驗操作，篩選、分離和純化霉變干酪，總共得到3株菌，酵母菌1株，青霉菌屬2株，編號為A7、A8、A9，其中A7為酵母菌屬，A8、A9為青霉菌屬。

2.1.1 菌落形態描述

在28±1℃連續培養到3代，得到單個菌落的純化菌種，培養至第4天拍照記錄。如圖1所示。

圖1 孟加拉紅培養基上各菌落圖

根據各菌落在不同培養基上的生長狀況，進行菌落形態描述，如表4所示。

2.1.2 菌體微觀形態

培養至第4天，用接種針挑取少量菌體進行鏡檢，結果如圖2所示。

微觀形態描述如表5所示。

表4 菌落形態特征描述

圖2 各菌落微觀形態圖

表5 菌體微觀形態描述

2.2 高通量測序

2.2.1DNA提取與PCR擴增結果

利用18S rDNA來鑒定真菌種類，提取到的總DNA以及擴增的電泳圖見圖1，根據PCR電泳圖可知1-5號樣品目的條帶大小正確，濃度合適，可進行后續實驗，而6號樣品的目的條帶未檢測到，無法進行后續測序實驗。

圖3 基因組DNA提取與PCR擴增電泳圖

2.2.2 樣品復雜度分析

2.2.2.1 OTU聚類

經過對所有樣品的測序結果進行分析處理，去掉測序質量差的序列后，MGL1-3 3個樣品共得到96046條高質量序列，序列平均長度為402.2，YGL1-22個樣品共得到73 643條高質量序列，序列平均長度為403.78，每個樣品得到的優化序列及序列平均長度見表6。對5個樣品的有效數據進行聚類分別得到9個、6個、5個、17個、37個OTU。

表6 各樣品序列統計及OTU聚類表

2.2.2.2 稀釋曲線

稀釋曲線是從樣本中隨機抽取一定數量的個體，統計這些個體所代表的物種數目，并以個體數與物種數來構建曲線。它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建rarefaction curve，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可得出樣本的測序深度情況。

圖4 樣品在相似水平為97%的稀釋曲線

從圖4可以看出，每個樣品在其測序數量下均達到了平穩期，即增加測序數量也沒有新的OTU出現，因此，本次測序深度足以檢測到樣品中真菌類群。

2.2.2.3 樣品中真菌類多樣性分析

本實驗采用 97%水平下的 ace、chao、shannon、simpson和微生物的OTU數量對樣品中真菌多樣性進行分析，具體指標見表7所示。

Shannon和Simpson均是用來估算樣本中微生物多樣性指數之一。Shannon值越大，說明群落多樣性越高，但該值并非單純表示樣品中存在物種的種類多少，還包含樣品中各物種所占比例，即不同物種之間個體分配的均勻性，分布越均勻其多樣性越高。simpson在生態學中常用來定量描述一個區域的生物多樣性，Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低。Simpson多樣性指數中稀有菌種所起的作用較小，而普遍菌種所起的作用較大。兩個指數都是反映樣品中菌群豐富度和均勻度的綜合指標。

由表5可以看出，樣品的測序覆蓋率在99%以上，樣品YGL-2的Shannon值最大，Simpson指數最小，OTU最大，說明它的微生物種類比較豐富，群落的多樣性比較高。樣品MGL-3的Shannon值最小，說明它的微生物種類多樣性比較低，物種分布不均勻，結合圖2可以得知，YGL-2中微生物種類有13種，MGL-3中僅有3種，與多樣性指數Shannon和Simpson相一致。

表7 不同樣品在97%相似水平下的多樣性指數

2.2.3 物種注釋

不同分類水平上的物種注釋，結果見圖2。

由圖5可看出，腐敗干酪外表霉變部分在目上的分類主要是酵母目和散囊菌目，腐敗干酪內部的菌種種類豐富，不僅含有酵母目和散囊菌目，而且包含有真菌銀耳目、肉座菌目、鎖擲酵母目，真核生物以及其他種類。腐敗干酪外表霉變部分在科水平上的分類主要是發菌科、酵母科和耶羅威亞酵母科，腐敗干酪內部的菌種，還包含有絲孢酵母科、未分類的肉座菌科、未界定的銀耳科和鎖擲酵母科以及Cystofilobasidiaceae、Mammalia和Choreotrichia。腐敗干酪中霉變部分在屬水平上的分類的主要菌群為青霉（發菌科，霉菌）、德巴利（氏）酵母屬、耐堿酵母屬和未分類的酵母菌屬，內部未霉變干酪的菌群種類更豐富，不僅包含有霉變部分的菌群，還有未分類的真核生物、絲孢酵母屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及Mammalia和Choreotrichia等。

3 結 論

通過傳統的微生物培養法，經過分離、純化得到3株不同的微生物，通過鏡檢和微生物形態學分析，得出三株微生物分別屬于酵母菌屬和青霉菌屬。

通過18S rDNA高通量測序法，根據稀釋曲線、OTU聚類以及樣品的多樣性分析來反映腐敗干酪中微生物的菌群，得出腐敗干酪中微生物菌群主要有青霉菌屬、德巴利（氏）酵母屬、耐堿酵母屬、未分類的酵母菌屬、絲孢酵母菌屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及未分類的真核生物。

3個霉變干酪樣品中50%～80%為青霉菌屬，20%～40%為德巴利（氏）酵母屬，其余為未分類的酵母菌屬。另外3個未霉變部分的微生物菌群比較豐富，包含有絲孢酵母屬、木拉克酵母屬、雙足囊菌屬以及Mammalia和Choreotrichia等13種微生物。

圖5 樣品在目、科、屬水平上的物種注釋

[3]LOUREIRO V,QUEROL A.The prevalence and control of spoilage yeasts in foods and beverages[J].Trends in Food Scienceand Technology,1999,10,356-365.