瀘州地區(qū)VDR基因FokI多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究*

曹 勇，高婧臻，王曉燕，陳 莊，陳 楓△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病科，四川瀘州 646000)

高血壓是目前影響人類(lèi)健康最常見(jiàn)的慢性疾病，可伴有心、腎、腦等器官功能或器質(zhì)性損害，亦是多種心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。國(guó)內(nèi)外的研究證實(shí)，降低血壓可以減少15%～30%心肌梗死的發(fā)生率及40%～50%的中風(fēng)發(fā)生率[2]。高血壓是基因與環(huán)境互相作用的復(fù)雜疾病，其病因及具體機(jī)制尚未闡明。近年來(lái)，維生素D水平與高血壓之間的關(guān)系引起廣泛關(guān)注，多項(xiàng)研究及調(diào)查[3-6]顯示高血壓患者血清中25羥基維生素D[25(OH)D]水平明顯下降，升高血清25(OH)D水平，高血壓的發(fā)生率下降，一般認(rèn)為高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與維生素D呈負(fù)相關(guān)，而維生素D各種生物學(xué)功能實(shí)施需通過(guò)維生素D受體(VDR)介導(dǎo)。但關(guān)于高血壓與維生素D受體相關(guān)性的研究較少。基因堿基的改變、缺失、插入，可以影響基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性的增強(qiáng)或降低，高血壓發(fā)生可能與VDR基因多態(tài)性有關(guān)。為此運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)與DNA測(cè)序相結(jié)合方式，探究VDR基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系，為揭示原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制提供分子依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 基于瀘州及周邊地區(qū)常住漢族人群，進(jìn)行常規(guī)血液體格檢查及相關(guān)問(wèn)卷調(diào)查后，依據(jù)2005年中國(guó)高血壓治療指南建議的標(biāo)準(zhǔn)[7]，即收縮壓(SBP)≥140 mm Hg或舒張壓(DBP)≥90 mm Hg，或已診斷高血壓正在服降壓藥的患者。高血壓組共415例，其中男性152例，女性263例，平均年齡(63.18±9.19)歲。血壓測(cè)量：血壓完成測(cè)量1次后，松開(kāi)臂帶，休息5 min后行下一次測(cè)量，共測(cè)量3次，取平均值并排除繼發(fā)性高血壓。另選取本地血壓正常的健康體檢者為對(duì)照組，并排除其他心血管疾病。共415例，其中男性133例，女性282例，平均年齡(62.22±6.27)歲，兩組間年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全部檢測(cè)和取樣已征得研究對(duì)象同意，個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1血液常規(guī)檢查 收集空腹靜脈血，分離血清及血凝塊，血清檢測(cè)血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、肌酐(Cre)等指標(biāo)，血凝塊分裝-80 ℃凍存。

1.2.2基因組DNA獲取 DNA的獲取參照莊盟血凝塊試劑盒，NanoDrop光度計(jì)測(cè)定260、280吸光度值，記錄純度和濃度，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR-RFLP結(jié)合DNA測(cè)序，檢測(cè)VDR基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性 (1)參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)引物序列，反向引物：5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′，正向引物：5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCT-3，并由上海生工合成。(2)通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段：PCR反應(yīng)試劑(天根生物科技有限公司)，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。(3)酶切鑒定：建立20 μL酶切體系，選用FokI限制性?xún)?nèi)切酶(NEB公司)對(duì)PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖電泳，Goldview染色，觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定基因型。(4)測(cè)序驗(yàn)證：隨機(jī)選取部分PCR產(chǎn)物測(cè)序(Thermo Fisher Scientific公司，上海)驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1VDR基因FokI位點(diǎn)基因型分析 VDR基因FokI分型標(biāo)準(zhǔn)：Ff基因型三個(gè)片段分別為70 bp、197 bp、267 bp，ff基因型為70 bp、197 bp兩個(gè)片段，F(xiàn)F基因型只有267 bp一個(gè)片段，其中70 bp片段較小，觀察不清，但不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定。測(cè)序后通過(guò)分析軟件核實(shí)PCR產(chǎn)物堿基序列，測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果與酶切結(jié)果相符，F(xiàn)okI位點(diǎn)基因型結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

2.2VDR基因FokI基因型和等位基因分布情況 在VDR基因FokI位點(diǎn)檢測(cè)到FF、Ff和ff基因型，3種基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.657，P=0.417)。等位基因f、F 頻率在高血壓組和血壓正常組為51.8%、48.2%和48.2%、51.7%，兩者構(gòu)成比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而FF、Ff和ff基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，F(xiàn)f+ff基因型頻率在高血壓組明顯高于正常血壓對(duì)照組(69.5%vs. 62.3%)，以FF基因型為對(duì)照，F(xiàn)f+ff基因型發(fā)生高血壓的風(fēng)險(xiǎn)增高，OR=1.488(95%CI=1.080～2.052)，見(jiàn)表1。

注：M(50 bp DNA marker);FF基因型(6,8);Ff基因型(3,5，7，9);ff基因型(1，2，4)

圖1 PCR產(chǎn)物FokI酶切后電泳圖

2.3VDR基因FokI位點(diǎn)不同基因型個(gè)體與臨床參數(shù)的關(guān)系 將FokI位點(diǎn)分為FF與Ff+ff基因型，分析臨床參數(shù)在不同基因型間的差異，發(fā)現(xiàn)TG、Cre在兩種基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SBP水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、DBP、脈率(PR)、FBG、TC、LDL-C、HDL-C兩種基因型間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 VDR基因FokI測(cè)序結(jié)果

基因型正常血壓組[n(%)]高血壓組[n(%)]基因型和等位基因比較OR(95%CI)PFF115(27.7)85(20.5)Ff+ff vs. FF1.488(1.080～2.052)0.015Ff199(48.0)229(55.2)ff vs. FF+Ff1.000(0.728～1.373)1.000ff101(24.3)101(24.3)ff vs. FF1.353(0.913～2.005)0.132F429(51.8)399(48.2)f401(48.2)431(51.8)f vs. F1.156(0.953～1.401)0.141

表2 VDR基因FokI不同基因型與臨床參數(shù)關(guān)系

2.4logistic回歸分析 以是否患高血壓為因變量，對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的3個(gè)變量(TG、Cre和FokI多態(tài)性)，進(jìn)行非條件logistic回歸分析，結(jié)果顯示FokI多態(tài)性、TG、Cre是高血壓發(fā)生獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3 高血壓發(fā)生相關(guān)危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

3 討 論

VDR在不同的細(xì)胞類(lèi)型、組織和器官中被發(fā)現(xiàn)，包括那些通常與體內(nèi)鈣平衡及骨代謝不相關(guān)的細(xì)胞，這表明VDR除了調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣平衡，可能也參與了其他重要的生物過(guò)程。VDR基因包括8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，目前報(bào)道多態(tài)性位點(diǎn)有ApaI、BsmI、FokI和TaqI，其中FokI多態(tài)性能夠編碼不同長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)[9]，所以在所有VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)中，F(xiàn)okI位點(diǎn)最具潛在功能。最近研究也顯示VDR基因FokI多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-13]。

本次研究分析瀘州地區(qū)高血壓組和血壓正常兩組間VDR基因FokI位點(diǎn)基因型和等位基因分布，發(fā)現(xiàn)高血壓和正常血壓組間基因型FF、Ff 和ff分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將基因型FF作為參照，F(xiàn)f+ff基因型的個(gè)體發(fā)生高血壓的風(fēng)險(xiǎn)增高，OR=1.488(95%CI=1.080～2.052)。與LI等[14]研究皮膚黑色素瘤與VDR多態(tài)性相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Ff+ff基因型能提高皮膚黑色素瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.26,95%CI=1.00～1.59)和ABD-ALLAH等[15]發(fā)現(xiàn)Ff+ff能增加Ⅰ型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)一致。與WANG等[16]在美國(guó)男性人群發(fā)現(xiàn)ff基因型能增加高血壓風(fēng)險(xiǎn)和SWAPNA 等[17]研究印度人群VDR基因FokI多態(tài)性與高血壓相關(guān)性，F(xiàn)F基因型能增加高血壓風(fēng)險(xiǎn)不一致。不同人群之間，由于遺傳、地理、環(huán)境等因素的不同，VDR基因多態(tài)性分布可能存在一定的差異。進(jìn)一步分析不同基因型的血壓水平，相對(duì)于FF基因型，F(xiàn)f+ff基因型收縮壓水平升高，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是樣本量不足，造成統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見(jiàn)明顯的差異。同時(shí)也探究了高血壓發(fā)生可能的危險(xiǎn)因素，經(jīng)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)FokI多態(tài)性、TG、Cre是高血壓發(fā)生獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，與朱旭明等[18]、洪卓周等[19]發(fā)現(xiàn)TG、Cre水平有助于預(yù)測(cè)原發(fā)性高血壓的發(fā)生一致。

不同區(qū)域的多態(tài)性對(duì)VDR基因表達(dá)影響各異，F(xiàn)okI為5′端第二個(gè)外顯子上的第一個(gè)起始密碼子ATG的T-C變異形成，此區(qū)一旦發(fā)生突變，可能影響人VDR蛋白質(zhì)的功能。雷紅等[20]研究顯示，與維吾爾族、漢族對(duì)照組比較，維吾爾族、漢族高血壓組VDR mRNA表達(dá)較低。最新研究顯示VDR基因FokI多態(tài)性與25(OH)D水平存在相關(guān)性[21-23]，夏盛隆等[24]探究維生素D受體基因多態(tài)性及血清25(OH)D水平與潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系，經(jīng)logistic回歸分析中發(fā)現(xiàn)血清25(OH)D缺乏與FokI突變基因型(Ff/ff)之間存在交互作用。當(dāng)體內(nèi)維生素D缺乏時(shí)，可能通過(guò)腎臟中腎素基因的表達(dá)、影響血管內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能來(lái)調(diào)節(jié)高血壓。推測(cè)FokI多態(tài)性可能改變VDR基因表達(dá)和蛋白活性，影響了血清中的維生素D水平，進(jìn)而引起血壓的改變。由于本次研究未檢測(cè)維生素D血清水平和VDR表達(dá)水平，不能闡述FokI多態(tài)性能否可以改變VDR基因表達(dá)，影響維生素D水平。為此下一步將結(jié)合維生素D血清水平、VDR基因FokI位點(diǎn)不同基因型VDR表達(dá)水平及活性等情況進(jìn)一步分析FokI多態(tài)性如何參與高血壓的發(fā)生。

4 結(jié) 論

綜上分析，認(rèn)為VDR基因FokI多態(tài)性與原發(fā)性高血壓發(fā)生易感風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而原發(fā)性高血壓的發(fā)生并不是單一基因突變引起的，可能由多基因位點(diǎn)突變共同參與的過(guò)程。但通過(guò)測(cè)定人群中特定基因型可有效評(píng)估高血壓發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)臨床高血壓的防治具有重要的指導(dǎo)意義。