CDKN2A單核苷酸基因多態性與妊娠糖尿病伴HBV感染的臨床相關研究

余水泉

(重慶市涪陵中心醫院醫學檢驗科，重慶 408000)

妊娠糖尿病(GDM)是指孕婦在懷孕前沒有糖尿病，懷孕中或生產后才發現的糖尿病。近年來，GDM在孕婦中的比例呈上升趨勢[1-3]，其危害眾多，尤其是對病毒性肝炎孕婦，不但影響胎兒在母體內的正常發育、增加母體和新生兒多種并發癥的發生，還會增加母體再次妊娠時糖尿病復發率。因此，探究GDM的發病機制，進行早期診斷，對干預治療降低GDM對母嬰的危害具有重要意義。國內外研究表明，病毒性肝炎會增加孕婦患妊娠糖尿病的風險[4]，另一方面，細胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)基因多態性與妊娠期糖尿病也有一定的相關性[5-6]，病毒性肝炎、CDKN2A基因多態性與妊娠糖尿病相關性如何，臨床研究報道較少。本研究以本院收治的健康孕婦、乙型肝炎孕婦為研究對象，采用飛行時間質譜檢測CDKN2A基因的多態性，分析探討乙型病毒性肝炎、CDKN2A基因多態性與妊娠糖尿病的相關性，為臨床提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年9月至2017年5月本院收治的攜帶慢性乙型肝炎病毒(HBV)的孕婦240例和未感染孕婦260例。納入標準如下：(1)攜帶慢性HBV：血清中HBsAg和HBV DNA呈陽性，肝功能正常的孕婦；(2)GDM：所有妊娠24～32周行75 g口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)檢測：空腹血糖>5.3 mmol/L,餐后1 h血糖>10.0 mmol/L,餐后2 h血糖>8.5 mmol/L，達到上述三項之一者,可診斷GDM。若上述節點血糖水平均小于臨界值，則診斷為正常糖耐量(NGT)。排除標準：(1)孕期合并其他感染，如妊娠高血壓患者，感染單純皰疹病毒、巨細胞病毒、風疹病毒、HIV等。(2)患有脂肪肝、肝硬化或肝癌等影響正常肝功能的孕婦。(3)孕前應用糖皮質激素類藥物、細胞毒性藥物等。(4)胎兒發育異常或多胎孕婦。根據參與孕婦是否含有HBV，將所有孕婦分為兩組：攜帶慢性HBV的孕婦240例(A組)，未感染HBV孕婦280例(U組)作為對照組。然后根據孕婦是否為GDM，將A組患者分為A1(HBV攜帶的GDM孕婦)和A2(HBV攜帶的非GDM孕婦)，U組患者分為U1(無攜帶的GDM孕婦)和U2(無攜帶的非GDM孕婦)。所有對象在知情同意下，簽署知情同意書，兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2方法 兩組孕婦空腹12 h后，口服75 g葡萄糖1 h，2 h，3 h后檢測各孕婦的血糖含量和各組孕婦的糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。根據OGTT的GDM診斷標準，分析比較兩組患者的GDM發病率。提取、保存各患者的DNA，采用飛行時間質譜測所有孕婦的基因型(送至重慶醫科大學進行檢測)，具體步驟如下：首先PCR擴增目的基因序列，將患者DNA與芯片基質共結晶后放入質譜儀的真空管；然后用強激光激發使基質晶體升華，核酸分子解吸附并轉變為亞穩態離子，在真空小管中飛行到達檢測器，最后檢測出各基因分型。分析孕婦CDKN2A基因rs10811661的三種基因型TT,TC,CC的分布及等位基因T和C的分布頻率。

表1 兩組孕婦一般資料的比較

2 結 果

2.1兩組患者妊娠糖尿病發病率比較 A組患者的GDM發病率與U組患者相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2兩組患者基因型分布的哈代-溫伯格定律檢驗結果 本研究提供500例患者，TT基因型181例，TC基因型183例，CC基因型136例，根據Hardy-Weinberg平衡定律公式：

[p(A)+q(a)]2=p2(AA)+2pq(Aa)+q2(aa)

p=(181×2+183)/1 000=0.545

q=(136×2+183)/1 000=0.455

計算H-W期望數=N(p2AA 2pqAa q2aa)，最后P>0.05，無顯著性差異。因此，本研究入選患者的基因型分布符合哈代-溫伯格定律。

2.3兩組患者的基因型分析及等位基因分布頻率比較 A組中，A1組孕婦182例，A2組孕婦58例；U組中，U1組孕婦60例，U2組孕婦200例。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三種基因型的分布在A1與A2中,差異具有統計學意義(P<0.05),U1與U2組之間差異不明顯(P>0.05)。CDKN2A基因rs10811661的TT,TC,CC三種基因型的分布在A1組與U1組有顯著差異(P<0.05)；A1組危險基因T的分布頻率高于U1組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 兩組患者妊娠糖尿病發病率比較[n(%)]

注：和U1組相比，aP<0.05

3 討 論

糖尿病是由各種致病因子作用于機體導致胰島素供應不足或胰島素在靶細胞不能發揮正常生理作用下，使體內糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝發生紊亂的臨床綜合征。GDM對母嬰的主要危害是增加了胎兒在宮內發育異常、新生兒窒息、畸形等不良結局的發生[7-8]。因此，GDM的早發現、早診斷、早治療具有重要意義。目前，GDM的具體發病機制尚不明確，但有研究報道，病毒性肝炎孕婦GDM發病率高于健康孕婦群體。肝臟是參與糖代謝的重要器官，感染HBV后，病毒繁殖激發機體正常的免疫系統，發生自身免疫，導致肝臟功能異常，進而會影響正常的糖代謝，甚至導致糖尿病的發生[9-10]。此外，還有研究顯示，位于9號染色體上的CDKN2A，抑制CDK4和CDK6的活性，CDK4的過表達又影響胰島B細胞的功能，使其受損從而減少胰島素的分泌，和Ⅱ型糖尿病的發生有關。在病毒性肝炎中，肝細胞CDKN2A的過表達和肝進行性纖維化、肝癌及膽囊癌的發生、發展有著密切的關系[11-15]。

本研究通過收集并比較本院收治的乙型病毒性肝炎孕婦及健康孕婦的GDM發病率發現，HBV感染孕婦GDM發病率為75.8%，而健康孕婦的GDM發病率為23.1%，HBV感染孕婦的GDM發病率顯著增加(P<0.05)。這一結果說明，HBV侵襲破壞肝臟細胞，使得孕婦肝功能異常肝臟受損，從而影響肝臟中的糖代謝過程，惡性循環最終會導致機體糖代謝發生紊亂。由于孕婦處于特殊時期，機體代謝負擔加重，一旦出現糖代謝紊亂很可能增加GDM的發病率。同時，本研究還將感染HBV攜帶GDM的孕婦與感染HBV的NGT孕婦進行了CDKN2A基因rs10811661分布多態性的比較，發現兩組患者CDKN2A基因的三種TT、TC、CC基因型分布明顯不同，感染HBV攜帶GDM的孕婦TT顯著增高(P<0.05)。未感染HBV患有GDM的孕婦與未感染HBV的NGT孕婦相比，CDKN2A基因rs10811661的三種基因型的分布差異無統計學意義(P>0.05)。但是感染HBV的GDM孕婦中與未感染HBV的GDM孕婦中有顯著差異，CDKN2A基因rs10811661的危險基因T的分布率也明顯不同。上述結果表明HBV感染、CDKN2A基因rs10811661 T/C多態性和GDM的發病具有相關性。機制可能是患有乙型病毒性肝炎，同時攜帶危險等位基因T的孕婦的胰島B細胞更易受損。但由于GDM是一種由遺傳、環境與生活習慣等因素共同引起的疾病，又因本研究樣本數量有限，故有待于進行大樣本、多基因、多因素的聯合分析。

本研究首次探究了HBV攜帶GDM孕婦和無HBV感染GDM孕婦的CDKN2A基因多態性分布情況。發現HBV攜帶GDM孕婦CDKN2A基因分布和HBV無GDM孕婦差異有統計學意義(P<0.05),等位基因T出現的頻率明顯增加。與此同時，與健康GDM孕婦相比，HBV攜帶GDM孕婦危險基因T的分布頻率顯著上升(P<0.05)，證實病毒性肝炎和CDKN2A基因rs10811661T/C多態性是GDM的發病有一定的相關性，是其發病的重要影響因素。