FeNO與誘導痰細胞分類檢測的相關性

陳華萍 唐心蔚 周雪梅 王 子 李 瑾 王關嵩

呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FeNO)檢測和誘導痰細胞分類檢查作為一種無創性檢查方法，越來越多的用于臨床，其中FeNO廣泛應用于哮喘的診斷、治療反應的監測以及哮喘患者癥狀控制情況的評估和急性加重的預測[1-5]。目前FeNO 檢測在我國臨床應用的時間比較晚，且在診斷哮喘的價值中各國研究結果報道亦不一致[6-8]。誘導痰細胞分類計數亦是評價慢性氣道炎癥疾病的重要檢測手段，在早期哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary, COPD)的病情判斷和療效監測中都發揮重要作用，特別在嗜酸性粒細胞性支氣管炎的診斷中，誘導痰中嗜酸性粒細胞所占比例>3%幾乎是該疾病的唯一診斷依據[9-11]。可見，兩項檢測均在肺部慢性炎癥疾病的診斷、治療和監測中發揮重要價值。FeNO檢測和誘導痰細胞分類檢查分別與外周血中嗜酸性粒細胞比例具有一定的相關性已有文獻報道[12]，然而FeNO與誘導痰細胞檢測間的相關性如何，目前這方面的研究報道甚少。我們分析了FeNO與誘導痰細胞分類檢測結果的相關性，以期為評估慢性氣道疾病的診治和監測提供指導意義。

資料與方法

一、一般資料

收集第三軍醫大學新橋醫院呼吸內科門診2018年1月至2018年6月同時檢測FeNO和誘導痰細胞分類項目的患者120例。依據FeNO值大于25 bbp分為FeNO正常組和升高兩組，其中FeNO正常組(FeNO值=16.28±5.77)男性19例，占33.9%，女性37例，占66.1%，平均年齡(47.18±10.88)歲；FeNO升高組(FENO值=57.36±5.89)男性28例，占43.7%，女性36例，占56.3%，平均年齡(43.29±12.63)歲。患者入選標準為：①18歲≤年齡≤75歲，性別不限；②有較好的依從性，能配合進行FeNO檢測和誘導痰白細胞分類檢測。排除標準: ①4周內全身使用或吸人糖皮質激素；②不能配合FeNO 測定及誘導痰白細胞分類檢測者。FeNO判定標準：≤25 ppb，正常；≥25 ppb，升高。誘導痰白細胞分類檢測參考值標準參考我們前期的研究結果[13]：細胞總數：(3.48±3.97)×106/g；嗜酸性粒細胞比例：(0.07±0.21)%；中性粒細胞比例：(37.02±13.68)%；淋巴細胞比例：(2.90±2.22)%；巨噬細胞比例：(60.7±13.67)%。

二、檢測方法

1. FeNO檢測: 以無錫納庫倫公司SV42E測定系統檢測患者FeNO值。檢測前向患者充分解釋收集氣體標本的呼吸方法，同時觀看錄像，直至患者完全理解。在FeNO測定系統聲光和內置動畫軟件的提示下，引導患者采用正確的呼氣方法，呼出氣流速依據美國胸科協會(ATS)及歐洲呼吸學會(ERS)測定指南進行[14]。囑咐患者先將肺部內的氣體盡量呼出，然后用口唇緊包過濾器，盡量用力吸氣5 s，然后再次囑咐患者用平穩的氣流速度再次將肺部內的氣體排出，并維持10 s左右，大約90 s后讀取儀器上顯示的數值。測定結果以ppb表示，所有患者的FeNO檢測均安排在誘導痰檢測之前進行。

2. 誘導痰細胞分類檢測

(1)霧化： 入選患者霧化前給予清水漱口，擤鼻以減少口中唾液的污染。高頻超聲霧化吸入3%高滲鹽水約10 min后，深部咳痰液于痰盒內。若患者前述霧化后仍無痰液咳出，或痰量不足，即換用4%高滲鹽水持續超聲霧化5 min，若仍無痰或痰量不足時，則換用5%高滲鹽水再霧化，5 min后則終止誘導霧化程序。

(2)痰液的選取： 選用誘導的痰液中黏稠的部分，同時顯微鏡下觀察痰液標本，選取無鱗狀上皮污染的痰液，丟棄唾液，留下合格的痰液標本(鏡下每個低倍視野鱗狀上皮細胞小于10個，中性粒細胞大于25個/視野)。

(3)痰液的處理： 將合格的痰液裝于5 ml離心管中，稱其質量(>0.5 g)，合格痰中加入4 ml的0.1%二硫蘇糖醇(DTT， DTT可將痰液中糖蛋白纖維絲之間的二硫鍵打開，使得痰液溶解, 使其中的細胞分散，且其對細胞形態無破壞作用，不影響細胞計數)，充分混合。將裝有痰液的離心管置于37 ℃水浴鍋中消化10 min，中途搖晃幾次，待痰液完全消化后，用48 μm的尼龍網過濾痰液，濾掉其中的黏液和碎片。收集痰液，以離心半徑8 cm，2 000 r/min離心10 min，去掉上清。向離心管底的細胞沉淀用200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，取20 μl細胞混懸液于細胞計數板中進行細胞總計數，所得細胞總數計算為細胞數除以質量，最終表達為：細胞個數×106/g。將剩余細胞混懸液用于細胞涂片，將涂片于37 ℃烤干后用甲醇固定10 min，瑞氏-吉姆薩混合染色10 min，沖掉染色液，于烤片機上37 ℃烤干后光鏡下進行400個非鱗狀細胞分類計數，包括嗜酸性粒細胞(eosinophile granulocyte, EOS)、中性粒細胞(neutrophile granulocyte, NEU)、單核一巨噬細胞(Monocyte macrophage, MON)、淋巴細胞(leukomonocyte, LYM)，計算各細胞所占比例。注意，痰液標本處理過程最好在2 h內完成。

三、統計學方法

結 果

根據FeNO判定標準：正常，FeNO值≤25 ppb；升高，FeNO值≥25 ppb。其中FeNO正常組，其中FeNO正常組(FeNO值=16.28±5.77)誘導痰細胞分類中細胞總計數(5.16±3.77)、嗜酸性粒細胞百分比為(1.18±1.99)%、中性粒細胞百分比(56.47±18.09)、淋巴細胞百分比(5.86±6.08)、單核-巨噬細胞百分比(35.12±14.47)；FeNO升高組(FeNO值=57.36±5.89)誘導痰細胞分類中細胞總計數(4.96±1.76)、嗜酸性粒細胞百分比為(11.56±12.80)%、中性粒細胞百分比(50.43±15.27)、淋巴細胞百分比(4.95±3.02)、單核-巨噬細胞百分比(31.33±13.28)；結果顯示FeNO值升高組較FeNO值正常組FeNO值和嗜酸性粒細胞百分比均顯著升高，且FeNO水平與誘導痰嗜酸性粒細胞百分比呈正相關，相關系數為0.701，兩組間細胞總數、中性粒細胞比例、淋巴細胞比例和單核巨噬細胞比例均無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 兩組間誘導痰細胞分類結果對比

注：aP< 0. 05，與FeNO 正常組比較

討 論

FeNO主要來自支氣管壁氣道上皮細胞、T 細胞、巨噬細胞，由于炎癥因子的刺激，上調誘導型一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase, NOS)，使NO產生增加，FeNO水平升高，可反映哮喘患者氣道炎癥嚴重程度[15]。目前研究表明NOS在哮喘患者的炎癥細胞和氣道上皮中表達較多，而在其他非哮喘患者細胞中表達較少，導致哮喘患者FeNO水平顯著升高[16]，這些奠定了FeNO檢測在哮喘的診治和臨床控制水平中的重要價值。誘導痰細胞分類計數檢測通過染色的方法可直觀的觀察患者痰中的各種細胞比例，其被作為判斷哮喘患者炎癥反應表型的金標準，在臨床應用中誘導痰細胞分類除了用于判斷和監測哮喘患者病情外，在慢性阻塞性肺疾病等其他肺部炎癥控制中也有一定指導意義。

從方法學角度分析，FeNO檢測具有無創、簡便、高效、快速、可重復性較好、測量能夠標準化等優點，既往研究亦表明FeNO測定能有效地監測炎癥變化和指導抗炎治療[17]。但是FeNO測定容易受到眾多因素的干擾，影響結果的準確性，如患者疾病的狀態、性別因素、吸煙和糖皮質激素以及種族等[18]。而誘導痰細胞分類檢測亦作為一種無創的檢測方法，其費用低廉容易被患者接受，目前其在臨床上的應用已積累了豐富的經驗，在哮喘、COPD、慢性咳嗽、肺結核等呼吸道疾病中有廣泛應用，在2015年全球哮喘防治倡議(GINA)以及各個國家哮喘防治指南中均得到推薦[19-20]。但是誘導痰細胞分類檢測操作程序較復雜耗時、檢測流程未標準化、各國無統一的參考值，以及需要專業的技術人員來操作等缺點。

從兩者在臨床應用角度分析，FeNO在哮喘的診斷和評價哮喘的治療反應和急性加重中已有廣泛應用，資料顯示FeNO<25 ppb時提示嗜酸粒細胞炎癥可能性低，而 FeNO>50 ppb則提示嗜酸粒細胞性哮喘[21]。FeNO檢測亦可用于預測吸入激素治療慢性咳嗽的反應性，以及鑒別COPD患者嗜酸性粒細胞的氣道炎癥表型[22]。誘導痰細胞分類檢測是鑒別慢性咳嗽(咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma, CVA)、鼻后滴流綜合征、胃-食管反流性咳嗽以及嗜酸性粒細胞支氣管炎(eosinophil bronchitis, EB))中EB的唯一方法，因為EB缺乏特征性的臨床表現，且部分臨床表現與CVA類似，其體格檢查亦無異常，EB的診斷目前主要依據誘導痰細胞分類中嗜酸性粒細胞百分百>3%判定。其次，誘導痰細胞分類檢測在哮喘的診治中可用于評價哮喘患者的氣道炎癥嚴重程度，以及藥物療效。在COPD的應用中誘導痰中性粒細胞數目可與肺功能聯合判斷患者的氣道炎癥情況。

本研究通過比較患者FeNO值與誘導痰中各細胞比例的關系發現，FeNO值升高的患者其誘導痰中嗜酸性粒細胞比例也顯著升高(P<0.05)，FeNO值正常的患者誘導痰中嗜酸性粒細胞比例也較FeNO升高組顯著降低(P<0.05)，相關性分析顯示FeNO水平與誘導痰嗜酸性粒細胞水平呈正相關(r=0.697)，說明兩種檢測手段結果一致性較好，均可反映氣道炎癥水平，這與文獻報道結果相一致[23]，誘導痰嗜酸性粒細胞作為氣道炎癥的重要生物學標志物，其水平亦可反映氣道炎癥的嚴重程度，FeNO檢測亦主要用于評價哮喘患者嗜酸性炎癥。

綜上，FeNO檢測和誘導痰細胞分類檢測在應用范圍和操作流程上均有自己的優缺點，但二者都不能被其中一個所取代，兩者互相彌補了各自的缺點。因此，在臨床應用中，將FeNO檢測和誘導痰細胞分類檢測有機的結合起來評價和監測慢性呼吸道疾病炎癥水平，對提高對患者疾病的管理和監測，也可為哮喘、嗜酸性粒細胞性支氣管炎和COPD診治和管理提供重要的輔助工具。