MEIS2、BRCA1表達的相關性及與術后非小細胞肺癌化療預后的關系

黃長江 聶婷婷 王迎難 倪吉祥

全球肺癌的病死率占惡性腫瘤病死率第一位[1]。肺癌按組織病理類型分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC主要分為鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌，其中NSCLC約占肺癌總數的80%～85%，NSCLC的治療包括手術、化療、放療、靶向治療等，對有手術適應癥手術切除的患者，仍有部分患者復發，化療對預防其復發具有重要價值[2]。人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)的表達與NSCLC化療療效及預后密切相關，其表達越低，化療療效越好[3]。在肺腺癌細胞中沉默MEIS2基因，BRCA1基因表達降低，提示BRCA1為MEIS2的下游基因[4]。MEIS2基因是同源異型盒基因( homeobox genes, HOX)的分枝基因，人類MEIS2基因位于染色體15q14[5]。MEIS2在個體發育中發揮著重要的作用，缺失后可導致個體發育異常；MEIS2基因在前列腺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤等中異常表達，但在肺癌中的研究目前國內外文獻報道較少[6-8]。研究MEIS2與BRCA1的關系有利于指導NSCLC接受鉑類藥物治療的預后，故研究MEIS2、BRCA1兩者表達的相關性及與術后NSCLC化療預后的關系有重要意義。

對象與方法

一、研究對象

選擇2012年2月至 2016年1月在三峽大學人民醫院(宜昌市第一人民醫院)住院患者61例，所有患者均行手術切除并經病理確診為NSCLC，收集患者的石蠟包埋組織標本及臨床資料，包括性別、年齡、病理類型、分期等。61例NSCLC患者中，>60歲31例，≤60歲30例，男性年齡42～80歲，平均年齡(62±11.1)歲，女性48～70歲，平均年齡(57±9.7)歲；男性43例，女性18例；鱗癌26例，腺癌35例。電話隨訪患者疾病進展情況，隨訪起點時間為NSCLC手術后，隨訪終止時間為2017年1月31日。

二、研究方法

61例NSCLC患者均經手術切除治療，按美國東部腫瘤協作組PS(performance status，體力狀況)評分<2分能耐受化療，術后接受以鉑類為基礎的第三代藥物聯合化療，化療方案為：DP方案：多西他賽+順鉑(卡鉑或奈達鉑)；GP方案：吉西他濱+順鉑(卡鉑或奈達鉑)；PC方案：培美曲賽+順鉑(卡鉑或奈達鉑)，共化療4～6周期。

1. 儀器與試劑： HistoStar組織包埋機、Scientific Shandon石蠟切片機為Thermo Fisher Scientific公司產品，二甲苯、蘇木素為上海川翔生物科技有限公司產品，抗原修復液EDTA為上海江萊生物公司產品，MEIS2一抗(SC-81986)、BRCA1一抗(SC-642)均為Santa公司產品。

2. 實驗方法： 收集經病理確診的石蠟包埋組織標本61例，運用免疫組織化學技術檢測MEIS2、BRCA1的表達。步驟為：石蠟切片、脫蠟、沖洗，修復液(EDTA)修復，加山羊封閉血清室溫下孵育10 min后，加一抗，沖洗，加二抗，37 ℃孵育60 min，沖洗，37 ℃恒溫箱中孵育10 min。PBS沖洗，組織切片上加現配DAB試劑，顯色5～10 min后置于蒸餾水中終止染色，運用蘇木素復染，用蒸餾水沖洗后鹽酸酒精分色后蒸餾水沖洗3 min，干燥脫水，中性樹膠封片后用顯微鏡觀察。

3. 判斷標準： 在顯微鏡下觀察，MEIS2蛋白陽性染色或BRCA1蛋白陽性染色為顯微鏡下細胞核或漿呈棕黃色沉著，每例切片至少計數10個200倍視野，視野中陽性細胞數<50%者判為低表達，視野中陽性細胞數≥50%者判為高表達。分析MEIS2、BRCA1表達與NSCLC術后化療療效兩者表達的相關性，按WHO實體瘤標準將療效分為：完全緩解(complete response, CR)，部分緩解(partial response, PR)，疾病穩定(stable disease, SD)，疾病進展(progression disease, PD)；CR+PR為近期客觀有效，有效者應1個月后隨訪檢查確認。無進展生存期(progression free survival, PFS)是從患者開始治療到腫瘤發生進展或死亡的時間，時間按月計算。

三、統計學方法

結 果

一、免疫組織化學染色結果

MEIS2、BRCA1在NSCLC組織中的表達情況，見圖1、2。由圖可知，MEIS2在細胞核、漿中呈棕黃色沉著>50%。BRCA1在細胞核、漿中呈棕黃色沉著>50%。

圖1 MEIS2在鱗癌及腺癌組織中的高表達(×200)

圖2 BRCA1在鱗癌及腺癌組織中的高表達(×200)

二、MEIS2、BRCA1的表達與臨床特征的關系

61例患者中，男性43例，MEIS2高表達者為24例，BRCA1高表達者為25例，女性18例，MEIS2高表達者為為11例，BRCA1高表達者為15例，61例患者中從性別、年齡、病理分型、TNM 分期，吸煙等方面進行統計分析，顯示MEIS2和BRCA1在NSCLC中的表達與上述臨床特征無顯著相關性(P>0.05)，見表1。

三、MEIS2、BRCA1的表達與接受鉑類藥物化療方案的關系

患者化療方案、臨床特征不一，為避免影響對化療療效的判斷，將MEIS2、BRCA1高低表達組與患者的化療方案進行統計分析，顯示在化療方案的選擇上無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

表2 MEIS2、BRCA1的表達與化療方案

注：DP：多西他賽+順鉑(卡鉑或奈達鉑)；GP：吉西他濱+順鉑(卡鉑或奈達鉑)；PC：培美曲賽+順鉑(卡鉑或奈達鉑)

四、NSCLC中MEIS2和BRCA1的表達相關性

61例患者中MEIS2和BRCA1兩者均高表達32例，均低表達18例，MEIS2高表達且BRCA1低表達3例，MEIS2低表達且BRCA1高表達8例，61例NSCLC患者中MEIS2和BRCA1的高表達率分別為57.38%(35/61)和65.57%(40/61)，兩者表達呈正相關(r=0.59，P=0.003)。

五、MEIS2、BRCA1表達與化療療效關系

對61例NSCLC 患者經至少2周期含鉑化療后進行隨訪，CR+PR共20例，SD12例，PD29例，MEIS2高表達中CR+PR有7例，5例SD，23例PD，MEIS2低表達中CR+PR有13例，7例SD，6例PD；BRCA1高表達中CR+PR有6例，6例SD，28例PD，BRCA1低表達中CR+PR有14例，6例SD，1例PD，MEIS2、BRCA1表達與化療療效有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 患者臨床資料及免疫組化結果

六、MEIS2、BRCA1表達與控制、進展率的關系

61例NSCLC 患者中，MEIS2高表達控制有7例、進展23例，MEIS2低表達中控制有13例，進展6例，兩者有顯著性差異(P<0.05)。BRCA1高表達控制有6例、進展28例，BRCA1低表達中控制有14例，進展1例，兩者有顯著性差異(P<0.05)。

七、MEIS2、BRCA1的表達與無進展生存期的關系

61例NSCLC MEIS2高表達患者的無進展生存期為：(31.44±0.41)個月，低表達患者為：(40.5±2.89)個月；BRCA1高表達患者的無進展生存期為：(26.49±0.37)個月，低表達患者為：(44.7±0.66)個月。MEIS2、BRCA1低表達的無進展生存期較高表達組長。Kaplan-Meier生存曲線并統計分析發現MEIS2、BRCA1的表達與無進展生存期有極顯著性差異(P<0.01)，見圖3～4。

圖3 MEIS2基因表達與疾病進展時間的關系P=0.000(月)

圖4 BRCA1基因表達與疾病進展時間的關系P=0.000(月)

討 論

肺癌是全球面臨的最嚴重公共健康問題之一，也是我國最常見的惡性腫瘤之一，2015年我國肺癌新發病例達73.3萬，死亡病例達61.0萬，死亡率和發病率均居惡性腫瘤的第一位[9]。肺癌可分為SCLC和NSCLC兩種病理類型，NSCLC主要分為鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌，85%左右的肺癌患者為NSCLC，近年來年輕肺癌患者且女性肺癌(尤其是肺腺癌)的發病率增加[10]。美國醫療保險數據庫統計，初診肺癌患者有57%已發生遠處轉移，喪失手術的機會，晚期肺癌一年生存率僅約10%左右，合理運用手術、放化療及分子靶向治療等方法，特別是化療仍然是控制腫瘤進展，延長生存率的重要措施[11-12]。NSCLC的分期采用IASLC(國際肺癌研究協會)第七版2009年或第八版2015年分期標準，對Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb期能耐受手術的NSCLC患者首選手術，部分患者經術前化療(新輔助化療)而降低腫瘤分期，再聯合手術治療，可延長患者生存率[13-14]。但在NSCLC患者手術治療后，術后轉移復發率高達80%[15]?；熆山档推鋸桶l率，故化療是NSCLC的重要治療措施，術后常使用含鉑兩藥化療方案治療4個周期，按美國東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)對體力狀況(performance status, PS)評分≤2分，主要器官能耐受化療的患者進行化療[16]。大部分NSCLC患者發現時已處于晚期，失去手術機會，采取多學科綜合治療與個體化治療相結合的原則，合理應用手術、化療、放療和分子靶向治療等手段，可以最大程度地延長患者的生存時間、控制腫瘤進展和提高患者生活質量[17]。

肺癌的發生與抑癌基因失活和癌基因激活相關，基因表達異常可致相關蛋白功能異常，可促進腫瘤的發生發展[18]。某些基因與腫瘤的預后相關，如文獻報道BRCA1基因表達水平與腫瘤接受鉑類藥物化療的敏感性相關[19]。我們運用短發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)干擾技術介導肺腺癌A549細胞的MEIS2基因沉默，shRNA介導的MEIS2基因沉默可誘導A549出現生長抑制、密度稀疏、細胞皺縮、流式細胞檢測提示細胞凋亡，G2/M期比例增高，基因芯片檢測DAVID分析發現DNA復制及細胞周期信號通路基因表達全面下調，BRCA1表達下調明顯，實驗驗證BRCA1 mRNA水平和BRCA1蛋白表達水平降低，MEIS2沉默后BRCA1表達也降低，顯示MEIS2在NSCLC細胞的調控中，BRCA1是其下游基因，MEIS2通過BRCA1調控NSCLCA549細胞生長及細胞周期阻滯[4]。MEIS2基因與肺癌的發生發展相關，是否也與接受含鉑藥物的化療敏感性相關，本文通過收集病例進行了探討。

人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)是首先被發現的具有遺傳傾向乳腺癌易感基因[20]。研究發現，鉑類藥物作用機制為在細胞核內與DNA結合，通過DNA鏈內、鏈間交聯，使DNA雙鏈、單鏈斷裂和損傷，抑制細胞分裂，殺滅腫瘤細胞而起治療作用[21]。BRCA1在鉑類藥物導致的DNA損傷中具有修復能力，故使鉑類藥物存在耐藥性，BRCA1高表達時提高了細胞修復DNA損傷的能力，導致鉑類藥物耐藥[22]。除了與DNA損傷藥物的關系外，BRCA1還具有調控有絲分裂的作用，BRCA1基因參與有絲分裂紡錘體的形成及染色體的正確分離過程，與紫杉類藥物(紡錘體毒性藥物)化療敏感性相關[23]。同時在腫瘤生長和轉移相關的血管生成過程中BRCA1也發揮了一定作用。BRCA1的表達與NSCLC化療療效及預后密切相關，其表達越低，化療療效越好，生存越長，反之生存越差[24]。

在生物發育中，其某一部位的性狀特征出現在其他部位的現象，稱為同源異形突變[25]。在研究果蠅胚胎發育過程中，發現果蠅的形態發育由一套基因編碼的蛋白質決定，若其中某基因發生突變，就會出現同源異形突變，所以稱這套基因為HOX基因(即同源盒基因或同源異型盒基因)[26]。同源盒基因分為2類，Ⅰ類為HOX基因，Ⅱ類為HOX分枝基因，包括TALE家族(含MEIS家族及PBX家族)、PAX等，人類MEIS基因家族成員包括：MEIS1、MEIS2、MEIS3[5]。MEIS2通常與PBX形成蛋白復合物，進而與HOX基因相互作用通過信號通路促進下游基因的轉錄并參與個體發育以及分化過程，MEIS2在個體發育中發揮著重要的作用[27]；MEIS2在斑馬魚中表達下調，其心臟發育則出現嚴重受損[28]；MEIS2與PAX3、PAX7相互作用調控頂蓋發育，在腦的發育中起重要作用[29]；MEIS2通過促進PAX6及cyclin D1在眼的及視網膜的發育中起重要作用[30]。MEIS2基因在腫瘤中常異常表達，提示MEIS2基因與腫瘤的發生發展密切相關，James等[6]報道MEIS2基因表達與前列腺癌的復發、轉移有關。Crijns等[7]報道MEIS2基因在卵巢癌中廣泛表達，并且可能在卵巢中起致癌作用，MEIS2基因在卵巢癌細胞株A2780中可降低對順鉑的藥物敏感性。MEIS2基因表達與卵巢癌的總生存率相關，MEIS2基因涉及卵巢致癌過程，可能在DNA結合，細胞周期控制，血管生成和細胞-細胞間信號傳遞等過程中起作用。

對本組61例NSCLC患者測定肺癌組織中MEIS2基因的表達情況發現，MEIS2的表達與性別、年齡、病理類型、臨床分期、吸煙狀況均無明顯差異性，但MEIS2和BRCA1兩者的高低表達存在顯著相關性。統計分析顯示MEIS2、BRCA1與NSCLC患者術后接受鉑類藥物化療的預后相關，MEIS2和BRCA1的表達越低，化療療效越好。但本文納入的樣本數量有限，尚需更多研究以進一步證實MEIS2與NSCLC患者接受鉑類藥物化療敏感性的關系，同時需進一步研究MEIS2與鉑類藥物敏感性的機制，以指導NSCLC的治療。