DCC基因對裸鼠皮下結直腸腫瘤的生長和淋巴管生成的影響

套格蘇,王 舉,胡 琦，姜洪偉*

(1.內蒙古醫科大學研究生學院,內蒙古 呼和浩特010110；2.內蒙古自治區人民醫院 胃腸外科)

DCC基因是由Fearon等[1]研究結直腸腫瘤時用定位克隆的方法確定并命名的一個腫瘤抑制基因，其編碼產物的氨基酸序列與神經細胞黏附分子有明顯的同源性。研究發現DCC轉錄物在結直腸腫瘤組織中顯著降低，在增殖性息肉上皮細胞中DCC蛋白表達十分明顯，而在被認為是結直腸癌前體的具有明顯不典型增生的晚期腺瘤中卻未見明顯DCC表達[2]。還有學者認為DCC基因失活可能是影響大腸癌預后的重要因素之一，肝轉移者發生DCC表達失活的主要機制是發生了基因突變[3]。本研究通過獲取基因片段，將目的基因插入到表達載體，并將人結直腸癌SW1116細胞懸液注射到裸鼠皮下，使裸鼠成瘤后進行相關的干預，再對相關指標進行測量，最后進行進一步分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物BALB/C雄性裸鼠15只購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物品系為無特定病原體BALB/C裸鼠，雄性，6-8周。聚合酶鏈反應(PCR)管、PCR儀等。

1.2 實驗方法

①通過基因合成方法獲得帶有DCC功能區的亞克隆質粒，通過金唯智基因合成獲得目的片段。將目的基因插入到表達載體,即將提取的質粒pUC57-DCC與載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統進行酶切鏈接。轉化到大腸桿菌，小量提取質粒。酶切鑒定并大量提取質粒，將提取的兩個質粒進行酶切鑒定。②人結直腸癌SW1116細胞培養：DMEM培養基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液，37℃5%CO2恒溫恒濕的細胞培養箱中培養。對已經長滿的細胞，棄去培養基，用磷酸緩沖鹽溶液漂洗一次，加入胰酶消化液，37 ℃孵育，待細胞完全脫落，加完全培養基中和胰酶，離心6 min(1 000 r/min，離心半徑為10 cm)，棄上清。無血清培養基洗2次，加5 ml無血清培養基懸浮細胞，計數。用無血清培養基將細胞濃度調至1×107個/ml。③將裸鼠在無特定病原體動物房飼養，自由飲食和飲水，適應性飼養7 d。第7天將SW1116細胞懸液注射到裸鼠皮下，每只小鼠注射0.2 ml。④建模第15天，觀察裸鼠成瘤情況，測量腫瘤大小。將裸鼠隨機分為3組(15只體重、年齡相等雄性裸鼠)，對裸鼠進行如下干預實驗：第1組：生理鹽水組(n=5，腹腔注射生理鹽水)；第2組：DCC干預治療組(n=5，瘤體內多點注射DCC質粒，注射50 μg，質粒濃度908 ng/μl)；第3組：5-氟尿嘧啶(5-FU)治療組(20 mg/kg體重，腹腔注射，連續15 d)。⑤經上述干預處理后，每周用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長與寬，稱量裸鼠體重，計算抑制瘤率；造模第30天處死裸鼠[由于給藥后第15天瘤體無明顯差異，因此多飼養了1周，即給藥后第22天(造模后第30天)取樣檢測]，剝離腫瘤，稱重，拍照，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

1.3 檢測相關指標

1.3.1細胞凋亡檢測 取1-2 mm大小的腫瘤組織，然后加入5-10倍體積的胰酶，37 ℃消化7 min，用5 ml含10%胎牛血清的培養液終止消化，過濾得到細胞懸液，將細胞懸液離心6 min(1 000轉r/min，離心半徑為10 cm)，得到腫瘤單細胞。后將細胞用磷酸緩沖鹽溶液洗1次后，重懸于1×結合緩沖液(Binding Buffer)中(將10×Binding Buffer用蒸餾水稀釋)。其中對照用400 μl 1×Binding Buffer，其他處理組用100 μl 1×Binding Buffer。每管加5 μl 磷脂結合蛋白(FITC-Annexin V)和5 μl碘化丙啶(50 μg/ml)。輕柔彈起混勻，室溫(25 ℃)避光孵育15 min。加400 μl 1×Binding Buffer至每管中，混勻。1 h內上流式分析軟件分析實驗數據。

1.3.2Western blotting檢測 ①蛋白樣品的處理與定量：用BCA法檢測細胞裂解液的蛋白濃度，測好濃度的蛋白分裝放于-80℃保存。②聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

1.3.3淋巴管計數標準 參照Weidner法進行淋巴管計數，在低倍顯微鏡(×100)下觀察全切片淋巴管分布情況后，選擇淋巴管密集的3個區域，以高倍顯微鏡(×200)計數每個區域的淋巴管數量，以3個區域平均值為該標本的淋巴管密度。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS 22.0進行統計分析。計量資料符合正態分布，用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。計數資料以例數和百分率表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 目的基因插入到表達載體

將提取的質粒pUC57-DCC和載體pCDNA3.1通過HindIII和XbaI雙酶切系統進行酶切。雙酶切鑒定可觀察到在300 bp處有特異性條帶。雙酶切和質粒測序結果表明pCDNA3.1-DCC中含有序列正確的DCC基因。見圖1、圖2。

2.2 對裸鼠瘤重的影響

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠的腫瘤重量分別為(0.353±0.119)g、(0.123±0.015)g、(0.147±0.041)g，差異具有統計學意義(F=8.903，P=0.016)；進一步兩兩比較結果顯示，與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠腫瘤重量均有所減輕，差異均具有統計學意義(P<0.05)，但DCC干預治療組與5-FU治療組相比，瘤重差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 細胞凋亡實驗結果

3組不同干預措施對裸鼠腫瘤細胞凋亡率的影響，經χ2檢驗結果顯示，3組裸鼠的腫瘤細胞凋亡率差異有統計學意義(χ2=21.362，P=0.000)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組總凋亡率均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.4 轉染后DCC蛋白的表達

轉染后，Western blotting檢測可以發現，曝光900秒掃膜未檢測到條帶，已重復3次，均未檢測到DCC蛋白，見圖3。可能與DCC蛋白的表達量特別低，信號較弱有關。

表1 3組不同干預措施對腫瘤細胞凋亡率的影響(%)

注：5-FU為5-氟尿嘧啶；a為與生理鹽水組比較，P<0.05

注：1為Marker；2、3為pUC57-DCC；4、5 注：1為Marker；2、3為pCDNA3.1-DCC為pCDNA3.1 注：1、2為生理鹽水組；3、4為DCC干預治療組；5、6為5-FU治療組；5-FU為5-氟尿嘧啶

圖1 pUC57-DCC和pCDNA3.1(+)圖2 質粒酶切鑒定電泳圖 圖3 Western blotting檢測轉染后DCC蛋白的表達酶切電泳圖

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達分別為1.556±0.088、2.061±0.075和2.052±0.114，差異有統計學意義(F=28.427，P=0.001)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組的DCC蛋白表達量均增加(均P<0.001)。

2.5 淋巴管計數結果

生理鹽水組、DCC干預治療組、5-FU治療組的淋巴管計數情況分別是(14.67±0.626)個、(8.43±1.002)個、(7.49±0.514)個，差異有統計學意義(F=6.489，P=0.039)。與生理鹽水組相比，DCC干預治療組、5-FU治療組裸鼠的淋巴管數量均減少，差異具有統計學意義(均P<0.05)。

3 討論

DCC基因位于人體染色體18q21.3，含有1.4 Mbp和29個外顯子。其表達蛋白是I型跨膜蛋白，由1 447個氨基酸組成，相對分子質量為190 000。DCC蛋白參與細胞之間、細胞與基質之間的相互作用，使細胞維持正常的生長和分化方式。當DCC基因發生缺失和突變后，DCC蛋白生成障礙，細胞的生長和分化紊亂促使細胞朝著惡性方向演變。DCC基因在絕大多數正常組織中均有表達，但在大多數結直腸癌組織中的表達卻有下調趨勢。DCC基因抑癌的機制與其能夠誘導細胞凋亡有關。作為依賴性受體，當配體Netrin-1存在時，DCC與其結合對細胞凋亡起到抑制作用，但當細胞缺乏Netrin-1配體時，DCC則誘導細胞凋亡。

DCC基因的胞內功能域(3 727-3 792 bp)具有誘導結腸癌細胞凋亡的作用[4]。DCC基因改變是癌變發生過程中的早期基因事件，其缺失或失活是腫瘤發生發展的一個促發因素。DCC蛋白的表達缺失與腫瘤浸潤轉移及細胞分化相關[5]。研究者發現大腸癌中DCC表達缺失頻率較高，可能通過上調Bcl-2蛋白表達和下調Bax蛋白表達阻止細胞凋亡，從而促進大腸癌的發生[6]。

Itoh等[7]研究了人結直腸癌中DCC mRNA的表達量，結果顯示與非癌組織相比，30例結直腸癌中的17例存在DCC mRNA低表達，且結直腸癌肝轉移的4個標本均表現為DCC mRNA的表達水平下降，該研究結果表明，DCC的功能性喪失，有可能是癌癥轉移的重要機制之一。

DCC基因的表達缺失可作為判斷大腸癌轉移潛能及預后的獨立指標[8]。大腸癌組織中確實存在DCC蛋白表達缺失，且與大腸癌患者Dukes分期有關；大腸癌組織中存在高頻率DCC基因啟動子甲基化的發生，且與直腸癌的關系更為密切；DCC基因啟動子甲基化可能是大腸癌中DCC失表達的主要機制之一。轉染的DCC基因可以抑制細胞增殖，導致癌胚抗原在SW1116細胞中表達下調，從而降低其浸潤和轉移能力[9]。

腫瘤抑制基因的存在主要是由3個方面提出的：一是通過與正常細胞雜交抑制腫瘤細胞的轉化表型；二是多種腫瘤的染色體缺失；三是腫瘤細胞特異染色體區域雜合性缺失。許多研究結果支持多種腫瘤抑制基因的劑量丟失或改變在廣泛的癌癥發生和(或)進展中起關鍵作用[10]。在中樞神經系統中，DCC表達較高，是軸突導向和神經元遷移的關鍵因子。最近，細胞培養實驗表明，Netrin-1和DCC是體細胞重編程的調節器[11]。

DCC誘導細胞凋亡的喪失也與結直腸腫瘤的數量和侵襲性有關，在誘發抑癌基因突變的背景下，導致高度浸潤性腺癌的發展。這些研究表明，DCC作為一個腫瘤抑制劑可通過其能力觸發腫瘤細胞凋亡[12]。

本研究采用PCDNA3.1(+)-DCC重組質粒轉染15例皮下結直腸腫瘤裸鼠后，檢測了DCC蛋白表達情況，結果表明DCC蛋白表達量降低，在3次Western blotting檢測中均未發現條帶(DCC蛋白)，說明在結直腸癌中DCC基因失表達。此外，癌組織中測得淋巴管的數量也顯著減少。更有說服力的指標是DCC干預治療組裸鼠的瘤重明顯小于生理鹽水組。研究結果還顯示，與生理鹽水組比較，DCC組總凋亡率有升高，說明DCC基因可誘導細胞凋亡，并可通過誘導細胞凋亡來抑制裸鼠皮下結直腸癌癌細胞的生長和增殖。

綜上，DCC基因能夠抑制結直腸腫瘤的生長和淋巴管的生成，且抑癌機制與其能夠誘導細胞凋亡有關。目前對DCC基因的研究有了很大的進步，但是關于DCC基因的失活機制、DCC基因與其他基因是如何協同作用于結直腸癌的發生、發展過程，如何誘導細胞分化等有待進一步研究。