二甲雙胍改善內皮細胞胰島素抵抗作用的研究

畢欣榮,陳澤姣,陳晨晨,印紅梅*,陳海燕*

(1.吉林大學第一醫院 干部病房，吉林 長春130021；2.長春市腫瘤醫院)

二甲雙胍是2型糖尿病的一線用藥，已經成為全球應用最廣泛的口服降糖藥物，已有確切證據表明二甲雙胍具有心血管保護作用，可以降低2型糖尿病患者心血管事件的死亡風險及急性心肌梗死的發生率，且這種心血管保護作用可能獨立于降糖作用之外[1]。目前認為二甲雙胍具有抑制動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗、提高心肌供能、抗炎、調脂、降壓、降體重的綜合作用，但其血管保護的確切機制仍然不明確。我們通過在體外培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，建立內皮細胞的胰島素抵抗模型，加入藥物二甲雙胍，觀察其對一氧化氮(NO)，內皮一氧化氮合成酶(eNOS)的影響，探討二甲雙胍改善胰島素抵抗內皮細胞功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 HUVEC由哈爾濱醫科大學生物化學實驗室饋贈。

1.1.2試劑 低糖DMEM培養基(美國Fisher Scientific公司)，胰島素(諾和靈R，丹麥諾和諾德公司)，地塞米松(遂成藥業有限公司)，葡萄糖注射液(中國大冢制藥有限公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，胎牛血清(GIBCO)，二甲基亞砜(DMSO)(SIGMA公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Amerson公司)，葡萄糖試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，NO試劑盒(南京建成生物制品有限公司)，ET-1試劑盒(南京建成生物制品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1血管內皮細胞胰島素抵抗模型的建立及鑒定 HUVEC 用 5.5 mM 的 DMEM 培養基培養。第3至4代內皮細胞，待細胞長滿培養瓶底后，倒掉舊培養基，用 D-Hanks 液輕輕蕩洗 3 次，加入濃度為 0.25%的胰蛋白酶液，鏡下觀察，待大多數細胞變圓后，棄消化液，加入 DMEM 培養基終止消化，用吸管輕輕吹打，使細胞分散，倒置顯微鏡下觀察，計數，然后用 DEME 培養液將細胞稀釋為 1×105個/ml 的細胞懸液，將處于對數生長期的細胞接種于 96 孔板上(接種密度 1×105個)，在 37℃，5% CO2飽和濕度培養箱中培養，于接種 12 h后，棄去原培養基，用 PBS 洗兩次，將細胞分為9組，每組6孔，加入200 μl不同胰島素濃度的培養液，其中一組為低糖DMEM培養基，即陰性對照組。其余8組分別在低糖完全培養基的基礎上配制成8種胰島素濃度不同的高糖培養液，配制濃度如下：1×10-2胰島素組(1×10-2mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-3胰島素組(1×10-3mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-5胰島素組(1×10-5mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-6胰島素組(1×10-6mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-7胰島素組(1×10-7mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-8胰島素組(1×10-8mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)、1×10-9胰島素組(1×10-9mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)，分別于加藥后繼續培養24 h、48 h、72 h后另取一塊 96 孔板，每孔加入工作液200 μl，選取 10 個孔分別加入標準液 1-10 μl并加入不同濃度的工作液使系統終體積為 210 μl。分別取各實驗組及對照組中的培養基 2 μl分別加入含 200 μl 工作液不同孔中，再加入工作液 8 μl 使系統終體積為 210 μl，另設空白對照孔及完全培養基組，加入 2 μl完全培養基，檢測 OD 值計算平均值。取培養基 2 μl，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，于37℃繼續培養15 min，酶標儀震蕩15 min，于492 nm波長下，酶標儀測定吸光度。

1.2.2二甲雙胍對胰島素抵抗內皮細胞的保護作用 我們成功的建立了胰島素抵抗的內皮細胞模型，選取1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)培養液處理的內皮細胞作為研究對象，將細胞分為10組，每組有6個孔。在普通培養基中添加不同濃度的二甲雙胍，配置成不同濃度的培養液。10組包括陰性對照組(正常的低糖培養基)，模型組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM 地塞米松)，二甲雙胍組(共8組，二甲雙胍的藥物濃度分別為：1×103mM、1×102mM/L、1×10 mM/L、1 mM/L、1×10-1mM/L、1×10-2mM/L，1×10-3mM/L、1×10-4mM/L)。各組在給藥后48小時，棄去上清液，從每孔中吸取2 μl，用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。采用硝基還原酶法測定一氧化氮的含量，采用放射免疫方法測定內皮素含量，采用方差分析，用SPSS 20.0 for Windows統計軟件對數據進行分析處理，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，檢測結果用平均值±標準差來表示，P<0.05被認為是有顯著的差異，P<0.01代表非常顯著的差異。

1.2.3Western blotting檢測eNOS表達 通過上述實驗，可篩選出二甲雙胍的最佳濃度和作用時間，使用Western blotting方法檢測eNOS的表達。通過目的蛋白與內參蛋白的灰度值來進行比較;使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 血管內皮細胞胰島素抵抗模型的成功建立

本實驗組在大量的前期工作中已經成功篩選出了內皮細胞胰島素抵抗模型的最佳胰島素及葡萄糖含量，本次實驗中，再次對此模型進行鑒定，采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量。如表1中所示，與對照組相比，1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)的上清液中葡萄糖濃度明顯增加，表明葡萄糖消耗顯著降低(P<0.05)，我們認為此時內皮細胞傾向于胰島素抵抗模型，表明模型建立成功。

表1 胰島素抵抗內皮細胞對葡萄糖的消耗

與對照組相比：*P<0.05,**P<0.01；與10-4mmol/L 胰島素組相比：△P<0.05,△△P<0.01。葡萄糖水平用來表示,單位mmol/L。

2.2 二甲雙胍對胰島素抵抗的內皮細胞的保護作用

2.2.1二甲雙胍對胰島素抵抗的內皮細胞NO和ET-1的影響 在成功鑒定內皮細胞的胰島素抵抗模型后，我們分別在低糖DMEM培養基上添加不同濃度的二甲雙胍，繼續作用48小時，再次進行葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖含量，并檢測反應內皮細胞功能的相關指標NO和ET-1。如表2及表3中所示，當藥物二甲雙胍作用48 h后，與對照組相比，在103-10-4mM二甲雙胍組葡萄糖含量均明顯減少(P<0.05)，表明二甲雙胍對胰島素抵抗內皮細胞葡萄糖消耗具有顯著改善作用。在10-1-10-3mM的二甲雙胍組NO含量顯著增加(P<0.05)，NO和葡萄糖沒有表現出明顯相關性(P>0.05)，反映出該藥物可直接增加血管內皮NO含量，而不依賴于葡萄糖含量的變化。ET-1的水平在10-1-10-3mM藥物組顯著性減少(P>0.05)，ET-1與葡萄糖也沒有表現出明顯相關性(P>0.05)，表明二甲雙胍在同一時間，降低了ET-1水平。

2.2.2二甲雙胍對胰島素抵抗的內皮細胞eNOS表達的影響 通過檢測了胰島素抵抗的血管內皮細胞模型組(IR組)，陰性對照組即低糖培養基培養的血管內皮細胞(NC組)和4組濃度不同的二甲雙胍組(二甲雙胍濃度分別為1×10-1mM、1×10-2mM、1×10-3mM、1×10-4mM)，通過半定量的分析方法檢測eNOS的表達，見表4、圖1。胰島素抵抗模型組的血管內皮細胞中eNOS表達比陰性對照組中正常血管內皮細胞明顯減少，而加入不同濃度的二甲雙胍后胰島素抵抗的內皮細胞中eNOS的表達均有明顯的增強，差異有統計學意義(P<0.01)，其中1×10-3mM的二甲雙胍組eNOS的表達最強。

表2 二甲雙胍處理HUVEC后NO 和ET-1的表達

A與模型對照組相比：P<0.01；b與陰性對照組相比：P<0.01；NO和ET1的水平用來表示,單位mmol/L。

表3 二甲雙胍處理HUVEC后血糖、NO 和ET-1的相關性

N=陰性，P=陽性 (P<0.05)

IR，insulin resistance，胰島素抵抗；NC，Negative control，陰性對照組

eNOS/β 肌動蛋白IRNCmetformin0.051±0.1160.236±0.198a0.736±0.211ab

acompare to IR,P<0.01；bcompare to NC,P<0.05。

3 討論

血管內皮功能異常是糖尿病血管病變的重要機制之一，目前認為胰島素抵抗與內皮細胞功能紊亂明顯相關。研究發現，生理濃度的胰島素可以刺激機體內皮細胞產生NO，起到舒張血管、增加血流的作用；但胰島素抵抗的病人由于其自身對胰島素的敏感性降低，NO的生成也相應減少，對血管的保護作用隨之減弱[2]。胰島素抵抗對脂質代謝也產生明顯影響，在胰島素抵抗狀態下，脂蛋白脂酶的敏感性降低，使得高密度脂蛋白生成減少，低密度脂蛋白生成增多，低密度脂蛋白是誘發動脈粥樣硬化發生和促進動脈粥樣硬化進展的獨立危險因素[3]。而胰島素抵抗是通過何種方式導致內皮功能障礙的，目前尚不明確。

目前胰島素抵抗內皮細胞的機制研究主要是采用動物模型和體外細胞模型，而后者由于其快速、簡便、節約的優勢，發展迅速。本課題組采用葡萄糖/胰島素/地塞米松多種藥物聯合作用進行體外細胞模型實驗，成功建立了胰島素抵抗的內皮細胞模型。我們篩選出了建立人臍靜脈內皮細胞胰島素抵抗模型的最佳胰島素及葡萄糖含量，通過葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量。與普通的DMEM低糖培養基相比，1×10-4胰島素組(1×10-4mM胰島素+30 mM葡萄糖+1 μM地塞米松)的上清液中葡萄糖濃度明顯增加，葡萄糖消耗顯著降低，這組內皮細胞成為最佳的胰島素抵抗模型。

目前有大量的臨床和基礎研究結果證實二甲雙胍對糖尿病的心腦血管并發癥具有降糖作用以外的很多益處，可以改善血管內皮細胞的功能,可能與二甲雙胍可增加eNOS的磷酸化及其表達，從而增加血漿NO水平及降低全身血管阻力，起到改善內皮功能的作用[4，5]。而胰島素抵抗狀態下，胰島素受體依賴的磷脂酰肌醇 3-激酶活性降低導致 NO 合成及釋放下降，內皮細胞失去 NO 的保護作用，從而加重粥樣硬化的病理變化[6]。胰島素抵抗可抑制eNOS活性使內皮細胞產生的NO減少，血管舒張功能進一步下降。而ET-1是一種強效的血管舒縮因子，NO 與 ET-1 是一對互相制約的因素，共同發揮作用維持血管內皮的平衡。而 eNOS 是激活 NO 發揮其生物學作用的重要物質。本實驗結果發現不同濃度的二甲雙胍處理后均出現血管內皮NO含量增加、ET-1水平下降，NO和ET-1之間呈負相關，且上述改變不依賴于葡萄糖含量的變化。同時我們通過半定量的分析方法檢測eNOS的表達情況。如圖1所示，胰島素抵抗的血管內皮細胞中eNOS表達較正常血管內皮細胞明顯減少，而加入不同濃度的二甲雙胍后胰島素抵抗的內皮細胞中eNOS的表達均有明顯的增強，這與Noble等人的研究結果一致，他們均認為二甲雙胍激活了內皮細胞AMPK活性，從而增強eNOS磷酸化及表達，達到改善血管內皮細胞功能的作用[7]。

二甲雙胍作用于胰島素抵抗的內皮細胞后，可以有效的升高NO水平，降低ET-1水平，增強eNOS的表達；在eNOS的作用下，血管內皮細胞通過上調NO和下調ET-1而起到對抗胰島素抵抗、保護內皮細胞、對抗粥樣硬化的作用。關于二甲雙胍保護血管內皮細胞的作用，還有很多其他的機制參與其中。Goldberg等人[5]在一項應用二甲雙胍14年的研究中發現該藥物可以增加應用者腸道中嗜黏蛋白-艾克曼菌的含量，調控腸道菌群達到降糖及抗動脈粥樣硬化的作用。也有研究表明二甲雙胍可通過抑制內皮細胞血管緊張素II受體1表達，而達到保護血管內皮功能，減緩糖尿病患者心血管事件發生的有益作用[8]。

綜上，二甲雙胍是2型糖尿病患者的首選口服降糖藥物，其確切的心血管保護作用已得到廣泛認可。本研究進一步證實了二甲雙胍改善胰島素抵抗的血管內皮功能與增強eNOS表達、升高NO水平有關，但確切機制還有待深入研究。