不同益生菌干預對高脂飲食誘導肥胖小鼠脂代謝及脂多糖影響的研究

方圓圓,吳 亞,陳彥輝,王建青,楊琍琦

(安徽醫科大學第二附屬醫院 兒科,安徽 合肥230000)

腸道菌群失調與肥胖和代謝紊亂密不可分[1-3]，腸道菌群通過神經、內分泌、代謝和免疫等途徑與大腦進行雙向調節，能夠影響宿主對食物的攝取[4]。益生菌以乳酸桿菌和雙歧桿菌為代表[5]，益生菌治療的出現有望糾正由肥胖導致的宿主相關代謝紊亂[6]。盡管益生菌對人體有益的分子機制尚不明確，但部分腸道菌群確可改善肥胖及其引起的相關代謝性疾病，這有可能與益生菌改善了腸道菌群優勢菌的分布從而增強上皮屏障功能，調節宿主免疫反應有關[7，8]。但目前有相關研究表明，并不是所有的益生菌均可有效降低體重，改善機體代謝紊亂的情況，甚至部分益生菌還有可能增加體重和脂肪含量[9-11]。本研究旨在探討兒科臨床上常用的兩種益生菌在不同的劑量下對于高脂飲食誘導的離乳期至性成熟前期肥胖小鼠的體重、相關脂代謝指標及脂多糖含量的影響，并動態檢測同組小鼠相關指標變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養108只3周齡雄性清潔級C57BL/6小鼠，體重11-13 g，由北京維通利華實驗動物公司提供。標準飼料及高脂飼料均由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。將實驗動物隨機分為6組：正常飲食對照組(NFD組，n=18)，高脂飲食組(HFD組，n=18)，高脂飲食+低劑量嬰兒雙歧桿菌干預組(HFD+LB組，n=18，含菌量為1×108CFU/ml)，高脂飲食+高劑量嬰兒雙歧桿菌干預組(HFD+HB組，n=18，含菌量為1×109CFU/ml)，高脂飲食+低劑量酪酸梭菌干預組(HFD+LC組，n=18，含菌量為1×107CFU/ml)，高脂飲食+高劑量酪酸梭菌干預組(HFD+HC組，n=18，含菌量為1×108CFU/ml)。各組在原有飲食基礎上，對照組及高脂飲食組給予生理鹽水灌胃處理，高脂飲食+益生菌干預組給予不同劑量益生菌混懸液灌胃處理，灌胃體積按照100 μl/10 g小鼠體重計算。各組均自由飲食，連續飼養5周，每天灌胃1 次。灌胃期間，每1 d稱量小鼠體重1 次，根據體重變化及時調整灌胃量。所有小鼠實驗期間自由攝食及飲水，控制環境溫度(22±2℃)和濕度(55%±10%)，明暗周期12 h。

1.2 菌種及實驗室制劑本研究菌種由山東科興生物科技公司提供，嬰兒雙歧桿菌菌粉含菌量為1×1011CFU/g，酪酸梭菌菌粉含菌量為1×109CFU/g，使用無菌生理鹽水配制成嬰兒雙歧桿菌含菌量為1×108CFU/ml、1×109CFU/ml，酪酸梭菌含菌量為1×107CFU/ml、1×108CFU/ml的混懸液分別進行灌胃。總膽固醇(TC)、 甘油三酯(TG)、 低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。脂多糖(LPS)試劑盒購自武漢基因美生物技術有限公司。

1.3 血脂相關指標檢測分別于飼養第一周末，第三周末，第五周末剖殺小鼠，每組每個時間點隨機剖殺六只，留取血液樣本，采用酶比色法按照試劑盒操作說明進行分析，應用全自動生化分析儀進行檢測。

1.4 脂多糖檢測分別于飼養第一周末，第三周末，第五周末剖殺小鼠，每組每個時間點隨機剖殺六只，留取血液樣本，采用酶聯免疫分析法按照試劑盒操作說明進行分析，通過標準曲線計算樣品中小鼠LPS濃度。

2 結果

2.1 不同益生菌對高脂誘導肥胖小鼠體重的影響

由表1可以看出，各組之間在起始體重上并無顯著差異(P>0.05)。各組小鼠在最終體重上均低于HFD組，且有統計學差異(P<0.05)，同時飼養第一周末，HFD+HC組小鼠體重相較于NFD、HFD、HFD+LC組已出現差異(P<0.05)。第三周末，益生菌干預各組小鼠與HFD組小鼠體重差異均有統計學意義(P<0.05)，HFD+LB、HFD+LC組在第五周末終體重上明顯高于NFD組，差異有統計學意義(P<0.05)。HFD+LB、HFD+HB組間小鼠體重于第五周末組間差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠體重的比較

注:與NFD對比，aP<0.05，與HFD對比，bP<0.05，嬰兒雙歧桿菌高低劑量組間對比，cP<0.05，酪酸梭菌高低劑量組間對比，dP<0.05。下同。

2.2 不同益生菌對高脂誘導肥胖小鼠血脂成分的影響

與NFD組相比，于飼養第一周末后檢測HFD組血清中TC、TG 、LDL含量均明顯增高(P<0.05)，HDL含量明顯降低(P<0.05)。益生菌干預各組與HFD組相比，至飼養第五周末血清中TC、TG 、LDL含量均明顯增高(P<0.05)，HDL含量明顯降低(P<0.05)。同時動態檢測小鼠血清中各成分的含量，TC大致呈先增高，后降低，再增高趨勢，TG、HDL大致呈先增高，后降低趨勢。見表2-5。

表2 血清TC的比較

表3 血清TG的比較

表4 血清HDL的比較

表5 血清LDL的比較

2.3 不同益生菌對高脂誘導肥胖小鼠脂多糖的影響

與NFD組相比，從飼養第一周末開始，HFD組小鼠脂多糖升高明顯 ，且有統計學意義(P<0.05)，益生菌干預各組與HFD組相比，至飼養第五周末血清中LPS含量均明顯降低(P<0.05)。同時血清中LPS動態變化也大致呈先增高，后降低，再增高趨勢。見表6。

表6 血清LPS的比較

3 討論

研究發現，肥胖以及一些代謝性疾病可能與炎癥反應有關。造成代謝異常的主要原因，是失衡的腸道菌群產生的脂多糖等內毒素進入人體，被免疫細胞識別后產生多種炎癥因子，使得機體進入低度炎癥狀態，從而產生代謝異常。例如，若長期進食高脂食物，可造成腸道菌群中革蘭陰性菌株的數量增多，導致腸道內脂多糖的大量生成，同時菌群比例的失調可引起腸黏膜中緊密連接蛋白ZO-1、occludin變化，從而導致腸道通透性的增加，繼而增加了脂多糖的吸收，導致炎癥反應，造成肥胖[12，13]。雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌已被多項研究證實確能改善高脂飲食誘導肥胖動物的肥胖指數、血脂紊亂及胰島素抵抗相關指標[14-17]。同時亦有研究表明，酪酸梭菌制劑在防治各種腸道疾病和部分腸道外疾病都是有比較顯著的效果，同時Hua等[18]研究發現，酪酸梭菌能刺激Th1 免疫反應，有效激活的單核細胞和DC 從而誘導和維持組織Treg 細胞，下調促炎性細胞因子和上調抗炎細胞因子，可改善機體炎癥狀態，除此之外，酪酸梭菌的代謝產物還能促進腸上皮細胞的再生和修復，可有效減少脂多糖的吸收。

本研究中，高脂飲食組與對照組第三周末體重有差異，從第三周末開始，益生菌干預各組體重明顯低于高脂飲食組，有統計學差異，說明益生菌能夠改善高脂飲食造成的肥胖。同時高低劑量益生菌干預組間對比發現，第一周末酪酸梭菌組間即出現差異，第五周末嬰兒雙歧桿菌組間出現差異，表明不同劑量的益生菌對于改善肥胖的程度不一，本研究中，高劑量益生菌干預組效果總體優于低劑量益生菌干預組。從血清中各組脂類分析中可以看出，高脂飲食組小鼠較對照組小鼠，TC、TG 、LDL含量均明顯增高，HDL明顯降低，說明高脂飲食能夠導致小鼠血液中的脂代謝異常，而益生菌干預后，各項指標有所好轉，但仍高于對照組，說明益生菌能夠改善小鼠血液中脂代謝情況，但尚未能完全恢復正常。對于高低劑量益生菌干預組間對比發現，嬰兒雙歧桿菌組間TC、LDL最終含量有差異，低劑量嬰兒雙歧桿菌干預組TC含量低于高劑量嬰兒雙歧桿菌干預組，而LDL呈現相反結果。酪酸梭菌干預組間TC、LDL最終含量無明顯差異。而TG、HDL含量在益生菌干預組間均有差異，高劑量益生菌干預組TG均明顯低于低劑量益生菌干預組，而嬰兒雙歧桿菌干預組中低劑量干預組HDL含量高于高劑量組，酪酸梭菌組間則相反，說明不同益生菌雖可改善小鼠脂代謝異常，但益生菌的種類和劑量不同致各項指標改善的程度不一。對比同組小鼠不同階段脂代謝各項指標變化可以看出，小鼠各項脂代謝指標改變有明顯的趨勢。從血清中各組LPS含量分析中可以看出，第一周末開始，高脂飲食組小鼠血清LPS含量即高于對照組，而益生菌干預各組LPS含量均明顯降低，說明益生菌干預后能改善機體炎癥狀態，對比同組小鼠不同階段LPS變化可以看出，小鼠LPS改變亦有明顯的趨勢，結合上述結果，說明益生菌干預小鼠肥胖有最優劑量與干預時間段。

本研究的創新之處在于選取離乳期小鼠進行干預飼養至性成熟前期，模擬兒童生長發育過程，再一次證明益生菌干預對于改善高脂飲食誘導的肥胖有效果，不同種類益生菌在不同劑量下對于肥胖個體改善的效果有差異，并且對于各項脂代謝指標的改善有側重性，同時動態檢測同組小鼠不同階段相關脂代謝指標及脂多糖的變化，提示在益生菌干預下相關指標有趨勢變化。本研究對于指導臨床應用益生菌干預兒童肥胖起到了很好的借鑒作用，但僅選取了兩種臨床常用益生菌，種類偏少，后期可進一步擴大研究范圍，同時可進一步研究出益生菌干預后相關指標的變化趨勢，為臨床用藥療程做指導。