玉米品種“家佳榮2號”雜交種子純度的SNP分子鑒定

姚宗澤，李 陽，郭宗娟，李軍萍，聶貴芳，趙自仙*，李云波

(1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.杭州中軟安人網絡通信股份有限公司，浙江 杭州 310012；3.玉溪農業職業技術學院，云南 玉溪 653100；4.文山市種子管理站，云南 文山 663099；5.安寧市農業技術推廣所，云南 安寧 650300)

【研究意義】玉米雜種優勢的利用為世界糧食安全做出了巨大貢獻，對種子行業的興起、飼料工業和畜牧業的發展有重大推動作用[1-2]。由于玉米雜交種生產有很大的經濟利潤，種子市場上常出現侵權或違規經營的行為，育種者、經營者或使用者均很重視種子質量。品種的真實性和純度鑒定對玉米品種保護和發展玉米生產具有重要作用，其中種子純度是種子質量的重要指標，是影響玉米產業的關鍵因素[3]。影響玉米雜交種純度的主要因素有機械混雜、生物學混雜等，其中母本去雄不及時、不徹底是影響種子純度的主要原因[4]。【前人研究進展】玉米雜交種純度鑒定的方法有很多，主要有田間種植鑒定和室內鑒定。田間種植鑒定是世界公認的最準確、最權威的純度鑒定方法，但時間長、用地多、成本高，對鑒定的技術人員有較高要求[5]。室內鑒定方法中，形態學鑒定易受環境、種子大小、顏色和成熟度的影響，準確性差；電泳譜帶鑒定技術和分子標記鑒定法[6]可以獲得較高的準確率，但操作復雜，成本較高，不利于推廣應用。單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代分子標記，它因可精確到基因組中的單堿基變異，深受國內外學者的關注。SNP是指在不同生物個體DNA序列中的同一位置上，單個堿基因插入、缺失、顛換、轉換等因素導致單核苷酸變異從而造成的基因序列多態性[7]，1996年由美國學者Lander[8]首次提出。SNP所形成的遺傳標記具有數量多、分布廣、適用于大規模試驗及容易估計等位基因頻率等特點[9-11]。SNP在基因組中分布率極高，是很多物種基因組的最常見形式。目前，國內外主要應用于水稻、玉米、辣椒等作物的基因分型和品種鑒定中[12-13]。迄今為止，已開發出多種檢測SNP的方法，如DNA測序法、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)、基因芯片(Genechips)、TaqMan探針法、高分辨率熔解曲線(High Resolution Melt,HRM)法等。其中，HRM是由于基因片段中的某一單堿基變異引起熔解溫度差異，形成不同的熔解曲線形態，從而檢測SNP位點，該技術可應用于基因分型、突變掃描、序列匹配檢測[14-16]。【本研究切入點】以玉米雜交種家佳榮2號及其父母本、近似雜交組合JR02為材料，采用田間小區種植鑒定和SNP分子標記中的HRM技術2種方法對雜交玉米家佳榮2號的同一批種子樣品進行純度鑒定，用JR02對SNP分子標記鑒定結果進行驗證。【擬解決的關鍵問題】通過研究，驗證SNP分子標記中HRM技術鑒定結果的可靠性，為雜交玉米種子純度鑒定方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究材料包括玉米家佳榮2號雜交種，家佳榮2號的父本LK-1及母本LK-4，JR02雜交組合，共4份。JR02雜交組合的母本與家佳榮2號的母本LK-4互為姊妹系，故與家佳榮2號有親緣關系，用來驗證所篩選引物的可靠性。研究材料均由云南農業大學趙自仙教授提供，家佳榮2號于2012年通過云南省品種審定，審定編號滇審玉米2012008號，區試中該品種表現出抗病性好、耐貧瘠、適應范圍廣，正在云南推廣應用。

1.2 田間小區種植鑒定

試驗在尋甸縣大河橋云南農業大學實踐基地進行，試驗地海拔1864 m，東經25°31′07″，北緯103°16′41″，試驗地塊肥力均勻、中等，前作無玉米種植。家佳榮2號雜交種子于2015年5月21日播種，小區行長3 m，行距0.75 m，穴距0.42 m，每穴2株，密度63 525 株/hm2。根據種子檢驗技術規程和國家種子質量標準[17]，玉米大田用種的種子純度要求96.0 %以上，需種植400/(100-96)，即100株以上，試驗實際播種150粒，符合鑒定標準。6月8日，記錄出苗株數，逐株編號掛牌并剪取葉片，單獨保存，作為室內DNA提取材料。每穴的栽培和管理措施一致，管理同大田生產，玉米生長前期不定苗、不間苗，及時防蟲。玉米開花期和成熟期，及時調查種子純度。

1.3 SNP分子標記

1.3.1 DNA提取 分別提取田間采集的家佳榮2號樣品DNA，用于室內雜交種子純度鑒定；再隨機取20個家佳榮2號單株葉片混合，提取總DNA，用于引物篩選。在室內培育家佳榮2號的父母本和JR02雜交組合幼苗，待玉米長到3～5葉期，每個材料取20個單株葉片混合，分別提取DNA，用于引物篩選及驗證。采用Saghai-Maroof[18]等于1984年提出的CTAB法提取DNA，再用1 %的瓊脂糖電泳檢測提取的DNA。

1.3.2 供試引物 通過查閱文獻，篩選到8對適用于SNP標記的引物(表1)，引物由前人用玉米自交系B73為背景的全基因組中開發而來。

1.3.3 SNP分子標記——HRM技術 引物篩選:通過實時熒光定量PCR擴增和擴增之后高分辨率熔解過程中熒光釋放量的采集，完成對樣品的基因分型以及引物篩選工作。在此過程中，對于同一對引物，采用3種不同顏色的線條分別代表雜交玉米品種家佳榮2號及其父母本，并繪制出家佳榮2號及其親本基因組與8對SNP引物在實時熒光定量PCR擴增以及擴增產物熔解過程中的原始熔解曲線、熔解峰、均一化熒光值熔解曲線和熒光值差異曲線，篩選出能準確區分家佳榮2號及其父母本的引物。

表1 SNP引物序列和編號

表2 Real-Time PCR反應體系

所用試劑MeltDoctorTMHRM Master Mix由賽默飛世爾科技有限公司提供，儀器為LightCycler480 Software Setup(Roche 羅氏)熒光定量PCR儀，8對SNP引物Real-Time PCR擴增反應體系見表2。試驗使用Real-Time PCR擴增，在擴增過程中對每個樣品的熒光釋放量進行采集，同時在擴增結束后增加一個60～95 ℃的升溫過程，并對各個樣品管的熒光釋放量進行采集和記錄，反應程序的設置見表3。

純度鑒定:在能準確區分雜交種與親本的引物中隨機選取一對引物，對田間采集的樣品進行純度鑒定，并用JR02加以驗證。

2 結果與分析

2.1 田間小區種植鑒定

玉米家佳榮2號于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲。第1次鑒定時間為7月26日，共鑒定了137株，異形株數為0；第2次鑒定時間為2015年10月3日，根據穗形、籽粒顏色、粒刺的有無、長短、粒型，并結合果穗大小等農藝性狀進行鑒定，共鑒定137株，異形株為3株，純度為(137-3)/137×100 %=97.8 %。純度鑒定結果取值，取第2次鑒定結果，即該批種子純度為97.8 %。

2.2 SNP標記

2.2.1 SNP引物篩選 在8對SNP引物的熔解峰結果中，引物P5的PCR產物熔解雜峰突出，峰值高，熒光值強度高。引物P1、P3、P4、P7、P8的雜峰不大突出，峰值較低。P2和P6的PCR產物熔解峰為單一峰。從均一化熒光值熔解曲線和差異曲線結果可知，引物P1、P2、P3、P4、P8可以準確區分玉米家佳榮2號雜交種子及其父母本，引物P5、P6、P7未能準確區分玉米家佳榮2號雜交種子及其父母本。能準確區分玉米家佳榮2號雜交種子及其父母本的這5對引物在親本之間多態性高，其中P1、P3、P4、P8的熔解峰圖均有雜峰，說明引物P1、P3、P4、P8在擴增過程中生成的少量引物二聚體或非特異性擴增產物對高分辨率熔解曲線準確度影響較小。引物P2的熔解峰為單一峰，說明該引物特異性高。引物P6、P7的均一化熒光值熔解曲線在雜交種和親本間幾乎重合，說明這兩對引物在親本之間沒有多態性。引物P5的基因分型結果不明顯，說明可能在擴增過程中生成了較多的引物二聚體或非特異性擴增產物，影響了高分辨率熔解曲線的準確度。

表3 Real-Time PCR 擴增程序

2.2.2 SNP分子標記純度鑒定結果 8對SNP引物中能準確區分雜交種與親本的引物共有5對，分別為引物P1、P2、P3、P4、P8，從中隨機選取引物P3，對田間采集的137個樣品進行純度鑒定。結果見圖1，從均一化熒光值熔解曲線圖C中可知，有133個樣品所對應的曲線位于雙親曲線之間，鑒定為家佳榮2號雜交種；其余4條曲線，有3條曲線幾乎與父本重合，編號分別為64號、67號、131號樣品；有1條曲線幾乎與母本重合，為85號樣品；均被判定為異品種，故引物P3純度檢測結果為(137-4)/137=97.1 %。

從圖2可知，JR02雜交組合的均一化熒光值熔解曲線以及差異曲線與家佳榮2號的曲線有明顯區別，說明引物P3能將玉米雜交種家佳榮2號與其近似組合JR02準確區分出來。

3 討 論

8對SNP引物所對應的熔解峰圖中，引物P5的PCR產物熔解峰雜峰突出，峰值高，熒光值強度高，可能是擴增過程中生成了較多的引物二聚體或非特異性擴增產物。引物P1、P3、P4、P7、P8的雜峰不大突出，峰值較低，在擴增過程中生成的引物二聚體或非特異性擴增產物的量較少。P2和P6的PCR產物熔解峰為單一峰，說明這兩個引物特異性高，無非特異性擴增產物和引物二聚體等生成。

A：原始熔解曲線；B：熔解峰；C：均一化熒光值熔解曲線；D：差異曲線A: Raw melt curves; B: Melting peak; C: The melting curve of normalized fluorescence; D: Difference curve圖1 引物P3鑒定“家佳榮2號”純度所得的高分辨率熔解曲線Fig.1 The high resolution melt curve for identifying ‘Jiajiarong No.2’ purity by P3

SNP作為第三代分子標記，與其它分子標記技術相比，在玉米基因組中廣泛存在，數量遠多于其它類型[9]，且具有非此即彼的特性[19]，整個操作流程可實現全自動化，人們可以從繁瑣的試驗操作中解放出來。本研究選取的HRM技術成本低、檢測周期短、操作較為簡便，樣品檢測量少。只有配置PCR反應體系屬人為操作，其它步驟均在qPCR儀器內完成。qPCR過程與常規PCR反應相比，僅在PCR結束后加一個高分辨率熔解過程(60～95 ℃)。操作過程中，只需記錄反應體系的熒光釋放量，即可達到品種純度鑒定的目的，基本實現了全程閉管操作，極大減少了污染源，整個鑒定過程均可實現自動化，減少了工作中的人為誤差。MeltDoctorTMHRM Master Mix熒光染料對PCR的反應沒有抑制作用，在DNA解鏈過程中也不會發生分子遷移，大大提高了HRM技術的準確性。然而SNP的HRM技術在鑒定作物品種純度也存在一定局限性，例如鑒定中需要雜交種雙親的DNA樣品，才能進行純度鑒定，此外成本也比其它部分分子標記技術高。任何DNA指紋技術都不是萬能，應該根據SNP檢測技術的優勢，充分發揮其在不同檢測項目中的作用[10]。隨著科技的進步，儀器、試劑等成本下降，SNP的HRM技術將會有廣闊的應用前景。

A：原始熔解曲線；B：熔解峰；C：均一化熒光值熔解曲線；D：差異曲線A: Raw melt curves; B: Melting peak; C: The melting curve of normalized fluorescence; D: Difference curve圖2 引物P3區分“家佳榮2號”及其親本和‘JR02’的高分辨率熔解曲線Fig.2 The high resolution melt curve for distinguishing between ‘Jiajiarong No.2’ and its parents and ‘JR02’ by P3

4 結 論

采用田間小區種植鑒定和SNP分子標記中的HRM技術2種方法對雜交玉米家佳榮2號的同一批種子樣品進行純度鑒定，驗證SNP分子標記鑒定結果的可靠性。結果顯示，田間小區種植鑒定純度結果為97.8 %，8對SNP引物中共有5對引物能準確區分玉米雜交種家佳榮2號和親本。隨機選P3為純度鑒定引物，純度鑒定結果為97.1 %，與田間鑒定結果接近。并用與家佳榮2號有親緣關系的玉米雜交組合JR02進行驗證，引物P3能準確區分家佳榮2號與雜交組合JR02。說明用SNP分子標記HRM技術鑒定玉米雜交種子純度結果可靠，可將其作為玉米雜交種子純度鑒定方法之一。