水稻—油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌的篩選和鑒定

楊敬林，張立成，廖健程，丁 鑫，程 哲，羅東城

(1.湖南農業大學工學院，湖南 長沙 410128；2.福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建 福州 350013；3.南方糧油作物協同創新中心，湖南 長沙 410128)

【研究意義】土傳病菌是土壤中一類對作物有致病害作用的微生物，該類微生物由土壤傳染至作物從而引起作物發病被稱之為土傳病菌[1]。引起作物土傳病害的病原物種類很多，包括真菌、細菌、線蟲和放線菌等，主要為真菌類微生物[2]。這些病原物能在土壤中快速繁殖生長，當土壤中病原微生物較多時，其通過作物根系侵入植株體內。立枯絲核菌是水稻連作土壤中常見的一類土傳病菌，不同作物之間的輪作栽培可以有效減輕這類土傳病的致病害作用[3]。利用自然環境中對土壤病原菌具有抗生、營養和競爭作用的微生物菌株進行作物病害的生物防治的重要措施。拮抗微生物具有抑菌效果穩定和抑菌機理多樣性特征，篩選和鑒定出拮抗病菌功能的微生物菌株在植物病害生物防治中發揮著重要作用。【前人研究進展】土傳病害常發生在作物連作栽培之后，例如，西瓜連作栽培易發生枯萎病，小麥連作栽培后土傳花葉病指數增加[4-5]。而通過輪作栽培可有效減輕作物的土傳病害作用，劉星以馬鈴薯—玉米輪作和馬鈴薯連作栽培進行比較試驗，發現連作土壤中對馬鈴薯具有致病作用的鐮刀菌屬類微生物相比輪作土壤的數量顯著增加[6]。連作栽培對根際土壤中微生物群落結構的影響是導致連作障礙的一個重要因素。Lang等人在棉花上的研究證明連作條件下微生物群落結構變化與土傳病害發生存在直接關系[7]。輪作可以減少土傳病害影響，在多類作物栽培實踐中得以驗證。目前對于輪作減輕土傳病害的機理尚不完全清楚，一般認為輪作維持土壤微生物多樣性平衡，控制土傳病菌的數量，也有學者指出輪作能夠降低土傳病菌在土壤中的富集[8-9]。輪作栽培后土壤中存在與土傳病菌相拮抗的微生物是土壤微生物多樣性平衡理論之一[10]。土壤為微生物生長提供良好的環境條件及養分資源，不同種類微生物為維持微生態系統平衡存在著相互拮抗作用[11]。相關學者在作物病害的生物防治研究中發現水稻連作易使其感染紋枯病，一種由立枯絲核菌引起的病害，而水稻和其它類別的作物輪作栽培則能減少紋枯病菌染病指數[12-13]。【本研究的切入點】我國南方地區多年的水稻—油菜輪實踐生產上，該種植方式下作物生長良好，作物發生土傳病害的染病指數較低。水稻—油菜輪作是一種水旱輪作方式，輪作后根際土壤微生物群落結構特征不同[14]。利用植株上附生或根際土壤中的拮抗細菌調控有害微生物的平衡，是有效防控土傳病的生物防治途徑。【擬解決的關鍵問題】本研究利用長期水稻-油菜輪作土壤中篩選出拮抗立枯絲核菌的有益微生物菌株及其拮抗細菌生理特征和分類進行鑒定，通過本研究以期為水旱輪作栽培生物防治土傳病害提供理論上的參考作用和菌株資源。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌株和培養基

供試病原菌：立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)由湖南農業大學植物保護學院提供。

NA培養基：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。該培養基用于培養土壤分離細菌類微生物。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH 7.0。該培養基用于培養病原真菌微生物。

圖1 安仁縣渡口鄉定位試驗田輪作和連作分區Fig.1 Lactation test field of rotation and continuous partition in Dukou village, Anren country

1.2 水稻-油菜輪作土壤微生物菌株的分離

試驗采集土壤來自于湖南省安仁縣渡口鄉(26°17′N、113°27′E)，長期(30年)進行水稻—油菜輪作的定位實驗田。試驗小區布置于圖1所示，左邊3個試驗小區為“稻-稻”連作，右邊3個試驗小區為“稻-稻-油”輪作 。將采集的新鮮土壤樣品用滅菌勺挖取一小勺放入裝有100 mL滅菌水的三角瓶中振蕩均勻，再從中吸取液體稀釋至10-6倍，最后吸取稀釋液0.1 mL均勻涂布在NA培養基上置于培養箱中培養72 h。培養完成后從平板中挑取不同類型的菌落在斜面上劃線純化保存備用。

1.3 立枯絲核菌拮抗菌的篩選

拮抗菌的粗篩：將立枯絲核菌病原菌接種至PDA培養基，用無菌水沖洗培養基表面菌群分生孢子，再通過無菌棉過濾配制成孢子懸液。取100 μl立枯絲核菌的孢子懸液均勻涂布在PDA培養基上，靜置培養24 h后用滅菌竹簽挑取“稻-油”輪作土壤分離的菌株進行接種。接種完成后，將PDA平板置于30 ℃恒溫培養箱中培養96 h后觀察菌落特征并測定接種分離菌株產生的抑菌圈大小。

拮抗菌的復篩：篩選出具有明顯抑菌效果的菌株，采用平板對峙法對拮抗立枯絲核菌進行復篩，對拮抗效果較好的菌株進行后續試驗鑒定。

1.4 菌株鑒別

試驗采用細菌培養基分離土壤微生物菌株，對分離出的拮抗病菌采用試劑盒法提取出DNA后再用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R進行PCR擴增，擴增片段長度約為1.4 kb。引物序列F: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，R: 5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’。引擴增程序為: 94 ℃預變性3 min，94 ℃變性 40 s，65 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，30個循環， 最后72 ℃延伸8 min。引物合成和測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。然后對擴增產物進行基因序列測定，將測序結果與GenBank數據庫中相似序列選用Blast方式進行片段相似性比對。用 DNAMAN 軟件將供試菌株的核糖體 16S rDNA序列與 GenBank 中的相關菌株進行序列同源性比對。

土壤篩分出的微生物菌株生理生化指標測定方法參照咸洪泉[15]編寫的《微生物學實驗教程》。

2 結果與分析

2.1 水稻—油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌初篩

應用稀釋涂平板法從水稻—油菜輪作實驗田土壤樣品中分離出77株菌，分別編號為1～77#。接種菌株后初步篩選出能在培養立枯絲核菌平板上產生菌圈直徑4 mm以上的菌株有21株，各菌株的菌圈直徑大小如圖2所示。應用平板對峙法進行復篩出對立枯絲核菌產生顯著拮抗作用的菌株有4株，菌株編號分別為4#、31#、36#、52#。

2.2 水稻-油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌的分子生物學鑒定

將 4株明顯具有拮抗立枯絲核菌的菌株進行16S rDNA基因片段PCR擴增，然后純化擴增產物對其測序。通過對菌株PCR產物DNA片段序列的測定，4株抗土傳病菌株序列長度相近，約為600 bp，但是組成DNA的堿基序列不同。把這些DNA片段測序結果輸入NCBI核酸數據庫進行Blast比對。應用Mega軟件將NCBI數據庫中的比對結果進行分析，所構建拮抗菌種屬關系的系統發育樹(N-J鄰接法)如圖3 所示。從該系統發育樹可以看出36#菌株和52#菌株構成一個小分支屬于一類微生物，4#菌株和31#菌株構成另一個小分支屬于一類微生物。36#、52#菌株與已鑒定出的菌株Bacillussubtilisstrain(枯草芽胞桿菌株)(登陸號：KX950669.1)和Bacillusvietnamensisstrain V21.33(越南芽胞桿菌種)(登陸號：KT720293.1)的種屬關系相近。4#、31#菌株與已鑒定出的菌株Bacillussp. oxC partial(芽胞桿菌oxC部分序列)(登陸號：AJ697957.1)和UnculturedBacillussp. clone TOPO1(芽胞桿菌的克隆培養TOPO1序列)的種屬關系相近。運用DNAMAN軟件對序列進一步分析，得出36#和52#菌株的同源性達97.8 %，因此可以認為從土壤中篩分出的兩株抗土傳病菌屬于同種微生物。相同的分析方法得出4#和31#菌株的同源性達98.5 %，這2株抗土傳病菌株也屬同種微生物。系統發育樹并沒有將4株待鑒定微生物菌株與已知菌株單獨構成一個分支，根據發育樹分支的相近性，可初步鑒定出36#和52#菌株屬枯草芽胞桿菌種，4#和31#菌株屬芽胞桿菌屬類微生物未鑒別種。

圖2 “稻-油”輪作土壤篩分的拮抗立枯絲核菌Fig.2 The isolated antagonistic Rhizoctonia solani of soil under rice-rape rotation

2.3 水稻-油菜輪作土壤拮抗立枯絲核菌的形態學和生理生化鑒定

篩選的4株菌株經革蘭式染色均呈陽性，其中4#和31#菌株所形成的菌落表面凸起邊緣光滑，菌落中心處為白色，四周為淡黃色，邊緣不規則。通過顯微鏡觀測4株菌的細胞呈直或彎曲桿狀，有鞭毛，無莢膜。從菌落特征和革蘭式染色觀察4株菌無明顯差異特征，說明這4株菌具有較高的相似性，其特征與芽胞桿菌屬微生物的形態學特征相符。

如表1所示，其中4#和31#菌株的生理生化功能特性相同，36#和52#菌株生理生化功能特性相同。這和前面的分子生物學分類結果相同，表明4#菌株和31#菌株是同一種菌株，36#菌株和52#菌株是同一種菌株。4#菌株和31#菌株的吲哚試驗、V-P試驗、苯丙氨酸脫氫酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗、硫化氫試驗檢測結果為陰性，其余指標檢測結果為陽性。36#菌株和52#菌株的V-P試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、硫化氫試驗檢測結果為陰性，其余指標檢測結果為陽性。4株菌株在鹽度小于8 %條件下均能正常生長，鹽度大于12 %時生長受限。根據4#菌株和31#菌株的生理生態特性鑒定可鑒定為彎曲芽胞桿菌，36#菌株和52#菌株的生理生態特性鑒定可鑒定為枯草芽胞桿菌。

3 討 論

水稻和油菜輪作栽培是我國南方地區常見的一種栽培方式，已有研究報道長期的輪作對土壤微生物群落特征有顯著的影響[16-17]。本研究是根據微生物之間存在不同菌類的相互拮抗作用這一理論從水稻-油菜輪作土壤中篩選出拮抗立枯絲核菌的有益微生物菌株，并對菌株種屬類別進行鑒定。土壤中微生物種類非常豐富，既有對作物產生有利作用的促生長菌也有對作物有害的致病菌[18]。立枯絲核菌屬于真菌類微生物，其對多種作物產生危害作用，尤其對水稻的致病作用較強，其致病機理是該病菌可以產生內毒素，抑制植物細胞的生長或使細胞過早死亡[19]。目前對該類病的防治主要是通過化學殺菌劑將病菌殺死，但化學殺菌劑除了殺滅病菌外，自身也會殘留在土壤中被作物吸收利用后將影響農作物品質安全[20]。而生物防治是一種對環境友好，有效減少作物土傳病害的方法。生物防治的基本特點是在土壤中形成一定數量的抗病菌類微生物，以優勢菌種在土壤中生存進而抑制有害病菌在土壤中的積累[21-22]。水稻—油菜輪作栽培下作物根際圈存在不同種類的微生物與根系之間的交互作用，微生物群落結構會隨栽種物不同而發生變化[23]。連作土壤中由于單一作物根系與土壤微生物交互作用，微生物群落結構穩定，有害病菌容易積累，當其數量在土壤微生物中達到一定比例時則會引發作物土傳病菌[24]。輪作后不同作物的根系分泌物有益于自身作物根際圈微生物的生長，而對別的作物根際圈微生物生長產生拮抗作用[25]。本試驗雖然已鑒別出水稻—油菜輪作土壤中存在彎曲芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌兩類具有抗立枯絲核菌的有益菌株，但對于有益菌株與有害菌株之間的拮抗作用機理有待進一步深入研究。

圖3 拮抗立枯絲核菌分子生物學的種屬鑒定Fig.3 Species identification by molecular biology for soil borne pathogens

表1 抗土傳病菌株生理生化鑒定結果

4 結 論

本研究是從長期水稻—油菜輪作試驗田采集土壤樣品，篩分具有拮抗立枯絲核菌的微生物菌株。結果發現，有4株明顯具有拮抗立枯絲核菌的微生物菌株，經過分子生物學和生理生態鑒定，這些菌株均為芽胞桿菌屬，其中2株為彎曲芽胞桿菌，另外2株為枯草芽胞桿菌。