6個獼猴桃品種抗潰瘍病差異及生理機制研究

李 靖，涂美艷,，鐘程操,，孫淑霞，陳 棟，宋海巖,，劉 飄，廖明安，江國良*

(1.四川省農業科學院園藝研究所·農業部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川農業大學園藝學院，四川 成都 611130)

【研究意義】獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性病害，由于其隱蔽性強、單靠藥劑防治難，近年在國內外產區危害甚重，已成為制約獼猴桃產業發展的重要瓶頸[1]。四川是世界紅心獼猴桃發源地和全球最大紅心獼猴桃種植區，其中，‘紅陽’品種占全省栽培面積的 65 %，大量研究表明[2-5]，現有獼猴桃栽培品種中，‘紅陽’抗性最弱，但國內高抗潰瘍病紅肉優質品種選育未見突破性進展。因此，短時間內通過品種改良解決潰瘍病問題還無法實現。而獼猴桃栽培品種間抗病性差異很大，因此，種植抗病品種是降低獼猴桃潰瘍病危害最有效的途徑之一。【前人研究進展】Kim等人的研究結果表明[6]‘紅陽’感病率最高，‘Hort16A’、‘Gold3’、‘Gold9’、‘海沃德’的感病率逐漸降低。李淼、張學武等人[7-8]研究發現中華系列獼猴桃在當地的感病程度明顯高于美味系列獼猴桃品種，‘金魁’為抗病品種，‘早鮮’次之，‘魁蜜’再次之，‘華美2號’、‘海沃德’中感病，‘秦美’、‘金豐’最感病。【本研究切入點】本研究團隊通過10余年研究，基本明確了四川省獼猴桃潰瘍病發生、發展規律[9-10]，結合已有研究結果，開展6個獼猴桃品種抗潰瘍病差異及生理機制研究。【擬解決的關鍵問題】以期從品種選擇、枝葉形態結構、生理生化指標等多方面闡明不同獼猴桃品種抗性差異的生理機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取了6個四川省主栽獼猴桃品種作為試驗材料(表1)。

健康的獼猴桃枝條、葉片采自成都市新都區泰興鎮四川省農業科學院現代農業科技創新示范園內(北緯N30°46′40″ 東經E104°13′2″，海拔481 m，年平均氣溫16.1 ℃，年平均無霜期279 d)。

盆栽苗：2014年秋季在控根容器(直徑20 cm、高30 cm)中栽植地徑0.8 cm以上實生苗(盆土采用草炭和蚯蚓糞1∶2比例混合，高壓滅菌后用于苗木栽植)，2015年6月嫁接不同供試品種。置于四川省農業科學院園藝研究所網室內，備試驗使用。

Psa菌劑：由四川省農業科學院植物保護研究所劉勇研究員課題組提供，該菌株于2014年從四川省都江堰市獼猴桃園分離獲得，通過PCR擴增得到的序列進行Blast比對分析，其DNA片段大小和序列與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種完全一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌菌懸液制取 吸取保存好的Psa菌液于 LB 液體培養基中，250 r/min搖床25 ℃下培養24 h，用無菌水將培養好的菌懸液制成濃度為 3×108cfu/mL 的菌懸液，以備試驗使用。

表1 試驗所用獼猴桃品種

1.2.2 獼猴桃離體枝條接種方法 2016年10月上旬于田間采集獼猴桃健康的一年生枝條，枝條粗度在0.8 cm左右，剪取其中部15 cm，用石蠟封住枝條兩端防止失水。用70 %酒精對枝條表面進行擦拭消毒，用已消毒的打孔器(直徑6 mm，面積28.3 mm2)在枝條中部造成傷口，傷口深至木質部，在傷口處注射20 μl Psa菌懸液，以接種無菌水為空白對照，接種后置于培養箱20 ℃恒溫保濕。每份材料取10個枝條，3次重復。24 h后逐日調查感病枝條，至20 d，統計感病枝條數，參照石志軍[4]的方法，計算病情指數，并對獼猴桃各品種潰瘍病抗性進行分級(表2、3)。

發病率=發病枝條數/試驗枝條數×100 %

病情指數=Σ(病級枝條數×代表級數值)/(總枝條數×發病最高代表級數值) ×100

1.2.3 葉片組織形態結構觀察 使用電鏡觀察葉片氣孔的密度、大小。取田間采集長勢一致的獼猴桃成熟葉片，置于2.5 %的戊二醛固定，保存于冰盒中帶回實驗室。用不同濃度酒精進行梯度脫水，在臨界點干燥儀中干燥后，將樣品進行噴金處理，于電鏡下觀察并拍照。氣孔密度為每平方毫米氣孔個數，隨機測4個視野的氣孔個數，重復3次，取平均值。氣孔大小為隨機測量的10個氣孔的長度和寬度的平均值，重復3次。制作石蠟切片：在采集的葉片上剪取長、寬均為0.5 cm的樣品，置于FAA固定液中固定24 h以上，使用梯度酒精和二甲苯進行脫水和透明，制作石蠟切片，用番紅-固綠對染，封片劑封片，在顯微鏡下觀察、拍照，測量葉片上表皮厚度、下表皮厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度，測定10組數據，重復3次，取平均值。

表2 獼猴桃潰瘍病病情分級標準

表3 抗性評價標準

1.2.4 枝條組織形態結構觀察 于獼猴桃成熟期(2016年9月10日左右)剪取6個獼猴桃品種的當年生枝條，選取長勢相同的結果母枝上從內向外第2～5節的枝條，重復5次。

皮孔觀察方法：將枝條直接置于解剖鏡下觀察，用顯微照相機拍照并測定各品種皮孔長度、寬度，記錄下皮孔形狀。在枝條上用解剖刀劃出整齊的方格，用游標卡尺量出方格的長度、寬度，由此計算出方格的面積，數出方格內皮孔數目，從而計算出各品種枝條的皮孔密度。每個品種測定10組數據，重復3次，取平均值。

芽眼觀察方法：選枝條上4～10節的芽(10個)在顯微鏡下進行解剖觀察，用顯微照相機拍照并測定各品種皮層厚度，重復3次。

1.2.5 盆栽苗接種Psa前后枝、葉相關生理生化指標變化 每品種選擇優質健壯1年生盆栽嫁接苗35株，其中，10株用于接種(重復3次)，5株作對照，試驗苗與對照組隔離開，避免病原菌侵染對照組。10月初選擇晴天下午5：00左右接種制備好的獼猴桃潰瘍病菌懸浮液。選取主干上距土表面15 cm處，接種方法同1.2.2，分別于接種前和接種后20 d，取葉片及枝條韌皮部，測定POD(過氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(過氧化氫酶)、PPO(多酚氧化酶)、PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性，以及可溶性糖、可溶性淀粉含量，測定方法均參照文獻[11]進行。

2 結果與分析

2.1 不同獼猴桃品種潰瘍病抗性差異鑒定

由表4可知，6個品種獼猴桃枝條接種Psa后的平均病情指數表明，其抗病性存在一定的差異。其中，‘翠玉’平均病情指數為35.24，抗性分級為耐病，‘東紅’、‘伊頓1號’、金果的平均病情指數分別為49.52，53.33，61.90，抗性分級為感病，而‘金艷’、‘紅陽’的平均病情指數分別為70.47和73.33，抗性分級為高感。這6個品種中，‘翠玉’的抗性最強，‘紅陽’的抗性最弱，沒有高抗和抗病型品種。

表4 不同品種獼猴桃枝條離體接種Psa的抗性差異

注：表中同列數據后小寫字母不同表示在5 %水平上差異顯著，大寫字母不同表示在1 %水平上差異顯著，下同。

Note： The differences in the lowercase letters of the same column data in the table are significantly different at the 5 % level, with different capital letters indicating significant differences at the 1 % level. The same as below.

表5 不同獼猴桃品種葉片形態結構比較

2.2 不同獼猴桃品種葉片形態結構差異比較

由表5可知，6個品種獼猴桃葉片形態結構存在差異，葉片氣孔密度、氣孔長度與離體枝條接種病原菌的平均病情指數分別呈極顯著或顯著的線性正相關(相關系數r分別為0.9636和0.8858)，海綿組織厚度與平均病情指數呈極顯著的線性負相關(相關系數r為-0.9442)。耐病型‘翠玉’的氣孔密度最低為245.92個/mm2，海綿組織厚度最大為76.27 μm，氣孔長度最小為14.79 μm。各品種葉片上表皮、下表皮、柵欄組織厚度、氣孔寬度之間有一定的差異，但與平均病情指數的線性相關系數r分別為-0.1587、-0.3221、0.0316和0.5042，沒有表現出顯著的相關性。

2.3 不同獼猴桃品種枝條形態結構比較

由表6可知，各品種獼猴桃的皮孔長度、寬度、密度、芽眼皮層厚度與平均病情指數的線性相關系數r分別為0.2037、0.2653、-0.020和0.4565，這幾個指標均與抗性未表現出明顯的相關性。依據各品種獼猴桃皮孔形狀，尚無法總結出明顯的規律。

表6 不同獼猴桃品種枝條形態結構比較

表7 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片SOD、POD活性的變化

表8 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片CAT、PPO、PAL活性的變化

2.4 不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片保護酶活性差異比較

由表7～8可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片的SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均表現出了不同程度的升高，說明接種Psa能引起葉片中保護酶的活性的提高。其中健康的‘東紅’葉片中SOD、POD酶活性最高，接種Psa后SOD、POD酶活性更是顯著高于其他3個品種，說明‘東紅’接種病原后葉片保護酶系統反應更強。不同獼猴桃品種接種前后，葉片中SOD、POD活性均與平均病情指數均呈線性負相關。而不同獼猴桃品種CAT、PPO、PAL活性與平均病情指數并無顯著的相關性。

2.5 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條保護酶活性差異比較

由表9～10可知，盆栽苗接種Psa后，各品種枝條韌皮部的SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均表現出了不同程度的升高，說明接種Psa能提高枝條韌皮部保護酶的活性。其中健康的‘東紅’枝條中SOD、POD酶活性最高，接種Psa后SOD、POD酶活性更是顯著高于其他品種。接種Psa前后，韌皮部中的SOD、POD活性與平均病情指數均呈線性負相關。它們均與葉片中相關酶活性變化保持一致。但不同獼猴桃品種接種前后PPO活性與平均病情指數呈線性負相關(相關系數r分別為-0.9850、-0.9380)。而不同獼猴桃品種接種前后CAT、PAL與平均病情指數無顯著的相關性。

2.6 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性糖含量變化

由表11可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片和枝條韌皮部的可溶性糖含量均表現出了不同程度的升高。其中健康的‘紅陽’葉片、枝條韌皮部中可溶性糖含量均最低，但接種Psa后變化率均顯著高于其他品種。不同獼猴桃品種接種Psa后葉片與枝條韌皮部中的可溶性糖含量與平均病情指數呈線性正相關。

表9 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條韌皮部SOD、POD活性的變化

表10 不同獼猴桃品種接種Psa前后枝條韌皮部CAT、PPO、PAL活性的變化

表11 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性糖含量變化

表12 不同獼猴桃品種接種潰瘍病菌前后枝條韌皮部、葉片可溶性淀粉含量變化

2.7 不同獼猴桃品種接種Psa前后可溶性淀粉含量變化

由表12可知，盆栽苗接種Psa后，各品種葉片和枝條韌皮部的可溶性淀粉含量均表現出了不同程度的升高，但變化率不同。不同獼猴桃品種接種Psa前后葉片、枝條中可溶性淀粉含量與平均病情指數無顯著相關性。

3 討 論

3.1 抗潰瘍病獼猴桃品種選擇

獼猴桃細菌性潰瘍病是威脅獼猴桃生長的首要病害，篩選和種植抗病品種是預防和控制病害流行最為有效的方法之一[12]，因此選擇抗病品種進行栽培尤為重要。離體枝條接種試驗明確了6個四川省獼猴桃主栽品種對潰瘍病的抗性，分別是‘翠玉’為耐病型(T)，‘東紅’、‘伊頓1號’、金果為感病(S)，‘金艷’、‘紅陽’為高感(HS)。其中‘紅陽’作為優質的紅心獼猴桃品種，深受消費者的喜歡，市場價值巨大，但實際生產以及前人試驗多次表明‘紅陽’對潰瘍病的抗性極弱，本試驗也得到了相同的結果。相比較而言，‘翠玉’品種的抗性要強于‘紅陽’，這為四川地區品種搭配提供了一定的參考依據。

3.2 抗性評價指標篩選

本試驗中獼猴桃葉片氣孔長度、密度、海綿組織厚度與各品種抗性呈極顯著或顯著的線性相關，這與李淼[7]對9個獼猴桃品種葉片組織結構的研究結果一致。葉片上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、氣孔寬度與抗病性不存在明顯的相關性。這可能由于病原菌是通過下表皮氣孔而非上表皮氣孔進入獼猴桃組織中。潰瘍病菌通過下表皮氣孔進入植物體內，葉片下表面氣孔越少，病原菌進入的通道越少；氣孔長度越小，通道越窄；葉片海綿組織越厚，其進入植物組織的通道越長，阻力越大，因而其抗性越強。因此，氣孔長度、密度、海綿組織厚度可作為篩選抗病品種的形態結構指標。

皮孔的大小、形狀、密度及芽眼皮層厚度均與抗病性不存在明顯的相關性。這與張小桐[13]的研究結果有所不同，其認為皮孔與抗逆性具有較大的相關性，這可能與試驗選材有關，兩個試驗材料品種完全不同，且取材時間以及觀察方法也不同，因此皮孔與獼猴桃潰瘍病抗性的相關性有待增加供試樹種，進行深入研究。

接種Psa后葉片、枝條中POD、SOD、CAT、PPO、PAL活性均出現了不同程度的升高，表明Psa能使植株產生應激反應，刺激保護酶的生成，健康的葉片、枝條中POD、SOD活性均與各品種抗性呈線性相關，這與石志軍等[4]的研究結果一致。但PPO、CAT、PAL活性與抗性不存在明顯的相關性。植物遭受病原菌侵染之后，細胞內自由基代謝平衡被破壞致使植物體內產生大量的自由基，SOD能催化自由基生成H202和O2，是減少自由基對組織產生損害的最關鍵的保護酶，而POD是廣泛存在于植物中的保護酶，在多數的生理反應中，它不僅能與SOD協同作用參與活性氧的清除，催化酚類物質形成醌類物質，同時參與合成木質素前體，形成了對抗病原菌的物理屏障，因此POD能通過多種途徑減少病原菌對植物體的損害。本試驗中枝條、葉片接種潰瘍病菌后，SOD、POD活性出現了不同程度的升高，且變化量存在顯著性差異，這與石志軍等[4]的研究結果一致，但與李淼[7]的研究結果有所不同，獼猴桃植株內保護酶對潰瘍病病菌的應激反應仍有待進一步研究。

健康的獼猴桃葉片、枝條中可溶性糖含量與各品種潰瘍病抗性呈線性相關，抗性越弱，可溶性糖含量越低，但接種潰瘍病菌后，可溶性糖含量出現了不同程度的增長，且抗性越弱，增量越大。而獼猴桃植株可溶性淀粉含量與抗病性并無明顯的相關性。

3.3 接種方法

本試驗采用了離體枝條接種來鑒定獼猴桃品種的抗性，這是一種廣泛運用于各種果樹抗病性鑒定的方法[14-15]。因為獼猴桃潰瘍病的病原菌Psa在生產中具有極強的傳播特性，為了避免對田間造成損失，使用離體接種的方法更科學、方便、快速。但另一方面，前人的研究中，田間實際的發病情況與離體接種發病情況仍有差異[4,7]。本試驗考慮使用離體枝條接種與盆栽苗接種相結合來對比相應的結果，但盆栽試驗未出現發病癥狀，只是部分生理指標發生了明顯的變化。因此在以后的試驗中，盆栽苗接種致病菌方法仍值得繼續研究。

4 結 論

綜上所述，本試驗以6個四川省主栽獼猴桃品種為試材，通過枝條離體接種和盆栽苗接種，鑒定其對潰瘍病的抗病能力，并從枝葉形態結構、生理生化指標上剖析了抗性差異的生理機制。結果表明：① 6個獼猴桃品種潰瘍病抗性由強到弱依次為‘翠玉’、‘東紅’、‘伊頓1號’、‘金果’、‘金艷’、‘紅陽’。②6個獼猴桃品種枝、葉形態結構存在明顯差異，葉片氣孔密度、氣孔長度與潰瘍病離體接種試驗病情指數呈極顯著或顯著正相關(相關系數分別為0.9636和0.8858)，葉片海綿組織厚度與潰瘍病離體接種試驗病情指數呈極顯著負相關(相關系數為-0.9442)，而葉片上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、氣孔寬度，枝條皮孔長度、皮孔寬度、皮孔密度、皮孔形狀、芽眼皮層厚度與潰瘍病離體接種病情指數無顯著相關性。③盆栽苗接種病原菌后枝條、葉片中SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性均出現了不同程度升高。健康葉片、枝條韌皮部SOD、POD活性與潰瘍病病情指數呈極顯著或顯著負相關。而葉片CAT、PPO、PAL、枝條韌皮部CAT、PAL活性與潰瘍病病情指數無顯著性關系。枝條韌皮部PPO活性與潰瘍病病情指數呈極顯著負相關(相關系數為-0.9850)。潰瘍病病菌接種前葉片、枝條韌皮部可溶性糖含量均與潰瘍病病情指數呈顯著負相關(相關系數分別為-0.9220和-0.8452)，但葉片、枝條韌皮部可溶性淀粉與潰瘍病病情指數無顯著相關性。