響應(yīng)面法優(yōu)化北豆根粗多糖的除蛋白工藝及其神經(jīng)保護(hù)活性研究

楊 培，張 瑞，翟 陽，丁 潔，董文亮，劉玉紅,2*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2山東省中藥材良種選育工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250355

北豆根為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC)的干燥根莖，有清熱解毒、祛風(fēng)止痛之功效，常用于咽喉腫痛，熱毒瀉痢，風(fēng)濕痹痛等證。北豆根中主要含生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等成分，目前對(duì)北豆根中的生物堿成分研究較多[1-3]，而對(duì)于北豆根多糖的研究鮮有報(bào)道。鑒于近些年中藥多糖廣泛生物活性的發(fā)現(xiàn)[4-7]，本文提取制備了北豆根粗多糖，研究了其對(duì)H2O2損傷PC12神經(jīng)細(xì)胞的作用，首次發(fā)現(xiàn)北豆根粗多糖具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)活性，可用于神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病的治療。

由于北豆根多糖的提取過程中有大量蛋白質(zhì)的浸出，經(jīng)測(cè)量，蛋白質(zhì)的含量高達(dá)40%，為了獲得純化的多糖組分，本文選用酶法、Sevage法、酶-Sevage法、三氯乙酸(TCA)-正丁醇法、酶-TCA-正丁醇法去蛋白，以多糖保留率和蛋白脫除率兩個(gè)指標(biāo)篩選出最佳除蛋白方法，并用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，確定了北豆根多糖穩(wěn)定高效的除蛋白方法和工藝，為北豆根多糖的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北豆根(產(chǎn)地山東，批號(hào)170501)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為防己科植物蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC)的干燥根莖。胰蛋白酶(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞(山東大學(xué))、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)、DMEM(美國(guó)Gibco公司)、三氯乙酸、正丁醇、福林酚等均為分析純。

LGJ-18凍干機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司)、紫外分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek Instruments)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北豆根多糖的提取

稱取北豆根藥材500 g，加入20倍量水，90 ℃下提取120 min，共三次，提取液過濾，棄去沉淀。減壓濃縮，加入4倍量無水乙醇，4 ℃靜置過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得北豆根粗多糖。

1.2.2 北豆根多糖除蛋白方法比較

1.2.2.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)

采用苯酚-硫酸法[8]測(cè)定多糖含量：

多糖保留率=A1/A0

A1為除蛋白后北豆根粗多糖中所含的多糖的質(zhì)量，A0為除蛋白前粗多糖中所含的多糖的質(zhì)量。

采用福林酚法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)含量：

蛋白清除率=(C0-C1) /C0

C1為除蛋白后北豆根粗多糖中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，C0為除蛋白前粗多糖中的蛋白質(zhì)質(zhì)量[10]。

綜合評(píng)分=0.5×(X/Xmax+Y/Ymax)×100

X為多糖保留率，Xmax為多糖保留率最大值，Y為蛋白清除率，Ymax為蛋白清除率最大值[11]。

1.2.2.2 胰蛋白酶法

取北豆根粗多糖500 mg，溶解并定容至50 mL，加入0.4 %胰蛋白酶。調(diào)pH7.8～8.5，37 ℃水浴攪拌6 h，期間不斷測(cè)pH，補(bǔ)加NaOH和水。攪拌完成后，調(diào)節(jié)pH至7.0，升溫至90 ℃并保持15 min，以滅活酶。將藥液冷卻至室溫，離心，收集上清液，冷凍干燥得去蛋白多糖，稱重，并測(cè)量多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.3 Sevage法

取北豆根粗多糖5份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號(hào)1、2、3、4、5，加入1/5的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)，振搖20 min，靜置5 min，離心并收集上清液，5份樣品分別重復(fù)上述操作1、2、3、4、5次，真空濃縮揮去溶劑，凍干并稱重，分別測(cè)量多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.4 酶-Sevage法

取北豆根粗多糖5份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號(hào)1、2、3、4、5，先依據(jù)1.2.2.2中的酶法進(jìn)行除蛋白，再用1.2.2.3項(xiàng)下的Sevage法除蛋白，分別重復(fù)1、2、3、4、5次，真空濃縮揮去溶劑，凍干并稱重，分別測(cè)多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.5 TCA-正丁醇法

取北豆根粗多糖2份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號(hào)1、2，分別加入2倍量TCA-正丁醇溶液(20%TCA∶正丁醇=1∶10)，振搖20 min，4 ℃放置1 h，靜置取下層，2號(hào)重復(fù)2次，真空揮去溶劑，凍干并稱重，測(cè)得多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.2.6 酶-TCA-正丁醇法

取北豆根粗多糖2份，每份500 mg，溶解并定容至50 mL，編號(hào)1、2，先用1.2.2.2項(xiàng)下的胰蛋白酶法除蛋白，再依據(jù)1.2.2.5項(xiàng)下的TCA-正丁醇法進(jìn)行除蛋白，分別重復(fù)1、2次，稱重并測(cè)量多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率和蛋白清除率。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白

選取三個(gè)對(duì)TCA-正丁醇法除蛋白效果影響較大的因素TCA 與正丁醇體積比(A)，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比(B)，振搖時(shí)間(C)為考查因素，根據(jù)Box-Behnken中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最優(yōu)值為中心點(diǎn)，上下各選一個(gè)水平值作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平，以多糖保留率和蛋白脫除率計(jì)算所得的綜合評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析(見表1)。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平表

1.2.4 北豆根粗多糖對(duì) H2O2誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

收集對(duì)數(shù)期的 PC12細(xì)胞，調(diào)整濃度為10×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合后，加入不同濃度的經(jīng)上述優(yōu)化工藝除蛋白后的北豆根多糖溶液100 μL，另設(shè)對(duì)照組和模型組[12-15]，均加入100 μL含2%血清的DMEM培養(yǎng)基。作用24 h后，除對(duì)照組外，其余各孔加入用培養(yǎng)基稀釋的0.75 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，然后每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。仔細(xì)吸去上清，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩混勻后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度值(測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm)，按照下面公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570)×100%[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同除蛋白方法考查結(jié)果

2.1.1 酶法

酶法除蛋白是利用蛋白酶降解多糖中的蛋白質(zhì)使其分解成小肽，處于較好的水溶性狀態(tài)，通過醇沉從而與多糖分離開來。酶法除蛋白后計(jì)算多糖保留率為59.82%，蛋白清除率為62.21%，由結(jié)果可以得出，酶法除蛋白雖然蛋白清除率較高，但是多糖損失較多。

2.1.2 Sevage法

Sevage法是多糖除蛋白較為常用的方法，該實(shí)驗(yàn)考查了用Sevage法除北豆根多糖中蛋白1-5次的效果，結(jié)果見圖1。隨著除蛋白次數(shù)的增多，蛋白脫除率逐漸增加，但多糖保留率也逐漸下降，第4次以后多糖保留率下降幅度明顯增加。因此，Sevage法除蛋白4次效果最佳，此時(shí)多糖保留率66.6%，蛋白清除率38.33%，

圖1 Sevage法除蛋白結(jié)果Fig.1 The results of Sevage method to remove protein

2.1.3 酶-Sevage法

酶法結(jié)合Sevage法除蛋白效果較Sevage法更好，蛋白脫除率更高，結(jié)果見圖2。隨著除蛋白次數(shù)的增多，蛋白脫除率逐漸增加，但多糖保留率也逐漸下降，當(dāng)除蛋白次數(shù)為3次時(shí)，多糖保留率為57.31%，蛋白脫除率為60.27%，為酶-Sevage法最佳除蛋白次數(shù)。

2.1.4 TCA-正丁醇法

TCA-正丁醇法也是多糖除蛋白較常用的一種方法，該方法效率較Sevage法高，一般只需操作一次即可，該實(shí)驗(yàn)比較了TCA-正丁醇法除蛋白1次和2次的效果，結(jié)果如圖3。由圖可知，該實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)兩次后，雖然蛋白脫除率增大了，但是多糖保留率也出現(xiàn)了大幅度的下降。因此TCA-正丁醇法除蛋白重復(fù)1次即可，此時(shí)的多糖保留率為82.4%，蛋白清除率為53.88%。

圖2 酶-Sevage法除蛋白結(jié)果Fig.2 The results of enzyme-Sevage method to remove protein

圖3 TCA-正丁醇除蛋白結(jié)果Fig.3 The results of TCA-n-butanol method to remove protein

2.1.5 酶-TCA-正丁醇法

結(jié)合酶法和TCA-正丁醇法對(duì)北豆根多糖除蛋白效果如圖4。由圖可知，該實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)兩次后，雖然蛋白脫除率增大了，但是多糖保留率非常低。因此酶-TCA-正丁醇法除蛋白重復(fù)1次即可，此時(shí)的多糖保留率為48.82%，蛋白清除率為79.62%。

2.1.6 不同除蛋白方法考查結(jié)果

按照上述確定的條件對(duì)5種除蛋白方法進(jìn)行比較，每種方法重復(fù)3次，結(jié)果見圖5，5種除蛋白的方法對(duì)北豆根多糖都有一定的脫蛋白效果，但是同時(shí)也會(huì)造成一定的多糖損失。從脫蛋白的效果來看，除了Sevage法蛋白清除率較低，其他四個(gè)方法的蛋白脫除率都還可以，酶-TCA-正丁醇法的蛋白脫除率最高，達(dá)到79.62%。而從多糖保留率來看，TCA-正丁醇法的多糖保留率最高。綜合考慮，北豆根多糖除蛋白以TCA-正丁醇法為宜。

圖4 酶-TCA-正丁醇除蛋白結(jié)果Fig.4 The results of enzyme-TCA-n-butanol method to remove protein

圖5 不同除蛋白方法結(jié)果比較Fig.5 Comparison of different protein removal methods

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

采用 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用自變量 A、B、C 表示TCA 與正丁醇體積比、北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比、振搖時(shí)間三個(gè)影響因素，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值(Y)。利用 Design Expert 8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到回歸模型參數(shù)和方差分析，其結(jié)果見表 2和表 3。

利用Design-Expert 8.06b軟件對(duì)TCA 與正丁醇體積比(A)、北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比(B)、振搖時(shí)間(C)三個(gè)因素對(duì)北豆根多糖除蛋白綜合評(píng)分(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立三元二次回歸方程：Y=91.32+0.64A-1.05B+2.57C-1.65AB-0.59AC-1.77BC-4.02A2-5.20B2-2.25C2。由表3的方差分析可以看出，該回歸模型P<0.05，說明回歸模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.476 0>0.05，差異不顯著，表明該未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，殘差均由隨機(jī)誤差所引起。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.930 7，說明該模型擬合度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。從 F值可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，振搖時(shí)間對(duì)多糖得率的影響最大，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比的影響次之，TCA 與正丁醇體積比的影響最小。交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著(P>0.05)；一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)A2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著(P<0.05)，二次項(xiàng)B2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，說明各工藝條件與北豆根多糖除蛋白的綜合評(píng)分之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是一種非線性關(guān)系。綜上所述，該模型擬合度高，可用該回歸模型來描述各工藝參數(shù)與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此可用該模型預(yù)測(cè)北豆根多糖用TCA-正丁醇法除蛋白的工藝條件。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 基于綜合評(píng)分的回歸模型方差分析

續(xù)表2(Continued Tab.2)

方差來源Source離差平方和Square sum自由度df均方Mean squareF值F valueP值P value顯著度SignificanceBC12.53112.532.020.198 4A267.99167.9910.950.013 0?B2113.681113.6818.300.003 7??C221.33121.333.440.106 2殘差Residual43.4776.21失擬度Lack of Fit18.7236.241.010.476 0絕對(duì)誤差Pure Error24.1546.19總離差Cor Total357.0216

注:*P<0.05，顯著；**P<0.01，極顯著。

Note:*P<0.05 Significant different；**P<0..01 extremely Significant different.

圖6 響應(yīng)面法優(yōu)化TCA-正丁醇法除蛋白的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of TCA-n-butanol method removing protein by Response Surface Method

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

通過響應(yīng)面3D圖能直接觀察因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響。如果響應(yīng)面圖曲線越陡，顯示綜合評(píng)分受該因素影響越大；反之，曲線越緩，表明綜合評(píng)分受該因素影響越小。影響北豆根多糖提取的各因子交互效應(yīng)的強(qiáng)弱則能通過等高線形狀體現(xiàn)出來。圓形狀等高線表示交互作用不顯著，而橢圓形等高線表示交互作用顯著。響應(yīng)面優(yōu)化具體結(jié)果見圖6。由圖可知，振搖時(shí)間對(duì)多糖得率的影響最大，北豆根多糖溶液與TCA-正丁醇溶液體積比的影響次之，TCA 與正丁醇體積比的影響最小且三個(gè)因素之間的交互作用不明顯。通過對(duì)回歸模型求解方程，得出北豆根多糖的最佳提取工藝條件為TCA∶正丁醇=1∶10.4，北豆根多糖溶液∶ TCA-正丁醇溶液=1∶1.77，振搖時(shí)間為36.5 min。此條件下北豆根多糖除蛋白的綜合評(píng)分的理論值為92.3。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕捎蒙鲜龉に嚄l件進(jìn)行北豆根多糖的除蛋白實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的可行性，將實(shí)驗(yàn)條件定為∶TCA∶正丁醇=1∶10.4，北豆根多糖溶液∶TCA-正丁醇溶液=1∶1.77，振搖時(shí)間為36.5 min，在此條件下，北豆根多糖的多糖保留率為62.9%，蛋白清除率為73.1%，綜合評(píng)分為92.1，與理論值相比相對(duì)誤差為0.16%。因此，基于單因素試驗(yàn)的響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，方法可行可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 北豆根粗多糖的神經(jīng)保護(hù)活性

北豆根粗多糖的神經(jīng)保護(hù)活性結(jié)果見圖7，空白對(duì)照組的細(xì)胞存活率為100%，而陰性對(duì)照組只加入H2O2損傷細(xì)胞4 h可明顯引起細(xì)胞的損傷，其細(xì)胞存活率為45.6%。加入不同濃度的北豆根粗多糖溶液后，細(xì)胞存活率都有不同程度的增加，北豆根粗提液中多糖濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為52.7%；多糖濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為58.5%，與模型組比較具有顯著性意義(P<0.05)。而當(dāng)北豆根粗提液中多糖濃度為200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到97.1%，與模型組比較具有極顯著性意義(P<0.01)。這說明北豆根多糖粗提物可以對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞損傷起到一定的保護(hù)作用。

3 討論

多糖主要以兩種形式存在，一種是純糖鏈，另一種是糖鏈和肽鏈結(jié)合，形成糖肽和糖蛋白。在多糖的研究中，蛋白質(zhì)的存在會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，在北豆根多糖的生物活性、藥用效果研究中，多糖的純化是首要和關(guān)鍵的步驟，多糖純度的高低直接影響后續(xù)的藥理活性、結(jié)構(gòu)分析及構(gòu)效關(guān)系研究的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室中常用的除蛋白方法有酶法、酶-Sevage法、三氯乙酸-正丁醇法等，這些方法在除蛋白的同時(shí)，也會(huì)對(duì)多糖造成一定的損失。本實(shí)驗(yàn)綜合了這幾種方法的多糖保留率和蛋白清除率兩個(gè)指標(biāo)，篩選出北豆根多糖除蛋白的最佳方法并通過優(yōu)化得到了最佳工藝，為后續(xù)北豆根多糖的研究奠定基礎(chǔ)。

圖7 北豆根多糖對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.7 The protective effect of Rhizoma Menispermi polysaccharide on H2O2-induced PC12 cell injury注：與模型組比較：*P<0.05 顯著；**P<0.01 極顯著。Note:Compared with the model group :*P<0.05 Significant different；**P<0.01 extremely Significant different.

北豆根具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛的功效，北豆根中主要的活性成分是生物堿，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗高血壓、抗心律失常等作用。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)北豆根多糖粗提液具有神經(jīng)保護(hù)作用。H2O2是產(chǎn)生活性氧成分的化學(xué)物質(zhì)，許多神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機(jī)制均與H2O2有關(guān)，常用作神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑，經(jīng)篩選得出濃度為0.75 μmol/L的H2O2作用于PC12細(xì)胞4 h可使細(xì)胞損傷50%左右。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)設(shè)置了空白對(duì)照組、模型組及藥物組，結(jié)果表明，當(dāng)加入不同濃度的北豆根粗多糖溶液后，經(jīng)H2O2損傷的細(xì)胞存活率顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，北豆根粗多糖溶液對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。由于北豆根多糖粗提液中多糖含量較低，后續(xù)我們會(huì)對(duì)北豆根多糖進(jìn)行分離純化，進(jìn)而研究北豆根多糖神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。本文研究為北豆根多糖進(jìn)一步應(yīng)用于氧化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。