響應面法優化水酶法提取辣木籽蛋白質的工藝及其功能性質研究

王標詩，李雪兒，梁小慧，胡小軍,2，張衛國,2，江 敏,2，楊 娟,2，張世奇,2

1嶺南師范學院化學化工學院；2廣東省辣木資源開發與利用工程技術研究中心，湛江 524048

辣木(Moringaoleifera)，又稱鼓槌樹、辣根樹、奇跡之樹等，也被稱為窮人的牛奶樹，日本譽其為不可思議之樹[1]。辣木是一種具有獨特經濟價值的熱帶植物，被譽為植物中的鉆石，受到了食品界、醫學界以及營養學界的重視。與普通的食品對比可知，辣木籽中蛋白質、膳食纖維、鈣、鎂、鉀等含量較普通的食品高很多，營養成分豐富[2]。在我國廣東和云南是辣木種植發展速度較快的區域。目前，辣木產業發展仍處于初級階段，遠不能滿足持續增長的辣木產業發展需求，急需獲得辣木精深加工技術的支持和推動。廣東湛江地區嶺南師范學院和中國熱帶農業科學院農產品加工所等單位對辣木研究較為深入，已聯合成立廣東省辣木資源開發與利用工程技術研究中心。

辣木的種子即為辣木籽。辣木籽中含有豐富的蛋白質、油脂及礦物元素，可用于食品、醫藥、化妝品等方面的產品開發，具有良好的應用前景。辣木籽的蛋白含量高，占總量的30%以上，含有17種氨基酸[3]。目前，辣木蛋白在飼料、凈水和化妝品等方面都有應用[4,5]。植物蛋白質的提取方法主要為堿溶酸沉法。目前，水酶法已在多種植物種籽中都得到了應用[6-8]，水酶法在提取蛋白質的同時可以有效的回收油料中其他營養物質，如油脂等，具有廣闊的市場前景。但是目前對于辣木籽中蛋白質的研究鮮有報道。

本論文以辣木籽為研究對象，通過響應面法優化了水酶法提取辣木籽中蛋白質的工藝條件，并對其部分功能性質進行了研究，以期為辣木的綜合開發和高值化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：辣木籽(購于湛江市旭昇南藥種植專業合作社)。胰蛋白酶(5萬U/g，國藥集團化學試劑有限公司)；Alcalase堿性蛋白酶(20萬U/g，北京奧博生物科技有限責任公司)；木瓜蛋白酶(20萬U/g，北京奧博生物科技有限責任公司)；中性蛋白酶(20萬U/g，北京奧博生物科技有限責任公司)；其他化學試劑均為分析純。

搖擺式高速萬能粉碎機：DFY-800，溫嶺市林大機械有限公司；電子天平：FA1004N， 上海精密科學儀器有限公司；自動定氮儀：KDN-103F，上海纖檢儀器有限公司；消化爐：上海纖檢儀器有限公司；高速離心機：HC-3518，安徽中科中佳科學儀器有限公司；精密pH 計：pHS-3C，上海雷磁儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

選擇色澤均勻、無蟲蛀、無霉變的辣木籽，置于50～55 ℃烘箱中烘72小時。取出放置干燥器中冷卻，用高速萬能粉碎機進行破碎，再用40目篩進行處理，得到辣木籽粉。然后把辣木籽粉置于50～55 ℃的烘箱中烘36小時。取出放置干燥器中冷卻，備用。

1.2.2 酶種類的選擇

參考李楊等研究方法[9]。分別將1.0 g辣木籽粉和水加入3個反應容器，其料液比為1∶10，調節pH 和溫度至蛋白酶水解的最適條件(胰蛋白酶pH8.0，37 ℃；，中性蛋白酶pH 7.5，40 ℃；Alcalase堿性蛋白酶pH9.0，55 ℃；木瓜蛋白酶pH 6.5，60 ℃)反應一定的時間。蛋白酶的添加量為4%。反應結束后將水解液于90 ℃條件下滅酶處理10 min，快速冷卻后4 000 rpm離心20 min，去除油脂層后上清液通過凱氏定氮法來測定其蛋白含量，以蛋白質提取率為指標評價酶的提取效果。

1.2.3 水酶法提取辣木籽蛋白質工藝流程

辣木籽粉→加水調配→調pH 和溫度→加入蛋白酶酶解→滅酶→離心分離→棄去殘渣和上層油→酶解液→測定蛋白質含量。

參考王勝男等研究方法[10]。準確稱取1.0 g辣木籽于干凈的燒杯中，按照一定的料液比加入水，調節pH 和溫度至蛋白酶水解的所需要的條件，按照一定比例添加蛋白酶，反應一段時間后于90 ℃條件下處理10 min進行滅酶，冷卻后在4 000 rpm的離心機下常溫離心30 min，棄去殘渣及上層油脂層后得到酶解液，用于蛋白質提取率的測定。

1.2.4 單因素試驗

單因素試驗分別探討料液比、酶添加量、時間、溫度和pH 對蛋白質提取率的影響。料液比分別選取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL；酶添加量分別選取2%、3%、4%、5%、6%；溫度分別選取40、45、50、55、60、65 ℃；pH 分別選取8、8.5、9、9.5、10；時間分別選取2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h。

1.2.5 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用響應面中心組合試驗設計優化Alcalase堿性蛋白酶在料液比為1∶10下提取辣木籽蛋白質的工藝參數。以溫度、pH 、時間、酶添加量為影響因素，以蛋白質提取率為試驗指標，響應面試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平表

1.2.6 蛋白質提取率的測定

蛋白質測定方法為凱氏定氮法，參考GB 5009.5-2010。

式中，E—蛋白質提取率，以%表示；m1—酶解液中蛋白質的含量，單位為g；m0—樣品質量，單位為g；c—樣品中粗蛋白的含量，以%表示。

1.2.7 辣木籽蛋白質氮溶解指數的測定

參考朱國君等研究方法[13]。首先將酶解液調整到辣木籽蛋白質的等電點，再將沉淀物冷凍干燥得到辣木籽分離蛋白。用分析天平稱取0.1 g辣木籽蛋白，配制成1%的蛋白質溶液，調整pH (2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)和溫度(25、35、45、55、65、75 ℃)，然后用磁力攪拌50 min，在4 000 rpm離心25 min，分別用凱氏定氮法測定上清液和辣木籽蛋白粉中蛋白質的含量，氮溶解指數(nitrogen solubility index)的計算方法如下：

式中，NSI—氮溶解指數，以%表示；m—上清液中蛋白質含量，單位為g；m0—樣品中蛋白質的質量，單位為g。

1.2.8 辣木籽蛋白質持水性的測定

參考朱國君等研究方法[13]。用分析天平稱取 0.1 g辣木籽粉蛋白于燒杯中，溶于加有 10.0 mL的蒸餾水中，分別調整pH (2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和溫度(30、40、50、60、70 ℃)，磁力攪拌50 min，充分吸水后，在2 000 rpm離心20 min，除去上清液，在50.0 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h后稱重。計算辣木籽粉蛋白的持水力(Water holding capacity)，以每g蛋白所吸附水分的重量來表示，計算方法如下：

式中，WHC—持水力，單位為g/g；m—吸收水分的質量，單位為g；m0—樣品中蛋白質的質量，單位為g。

1.2.9 辣木籽蛋白質吸油性的測定

參考范三紅等研究方法[14]。用分析天平稱取0.5 g辣木籽蛋白置于10 mL離心管中，加入3 mL花生油，振蕩1 min后，分別置于25、35、45、55、65、75 ℃的水浴鍋中保溫30 min，使之充分吸油，1 000 rpm離心20 min ，吸去上層未被吸附的色拉油后稱重，計算辣木籽蛋白的吸油性，以每g蛋白樣品吸附油的g數表示，計算方法如下：

式中，OA—吸油性，單位為g/g；m0—蛋白質的質量，單位為g；m1—蛋白質質量+離心管質量，單位為g；m2—吸油后蛋白質的質量+離心管的質量，單位為g。

1.3 數據分析

以上試驗數據均重復測定3次，其結果以平均值±標準偏差的形式表示。采用Excel軟件和Design-Expert 軟件對實驗數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 辣木籽蛋白質含量的測定結果

通過凱氏定氮法測定了辣木籽的粗蛋白含量為38.08%±1.36%。劉華勇[3]測定了辣木籽中蛋白質含量為38.49%，段瓊芬等[4]測定了辣木籽的蛋白含量為37.00%，樊建麟等[11]研究表明，辣木籽的蛋白含量為37.80%，這些數據都與本實驗的測定結果比較接近，產生差異可能是由原料的來源和成熟度等不同所致。

2.2 酶種類的選擇結果

由圖 1可知，在其他條件相同及各種酶的最適條件下，蛋白質提取率最高的是Alcalase堿性蛋白酶，提取率達61.20%，其次是中性蛋白酶。而最低的為木瓜蛋白酶，提取率僅為33.56%。所以確定提取辣木籽蛋白質的最適酶為Alcalase堿性蛋白酶。

圖1 酶的種類對辣木籽蛋白質提取的影響Fig.1 Effects of enzymes on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.3 辣木籽油水酶法提取單因素實驗結果

2.3.1 料液比對辣木籽蛋白質提取率的影響結果

圖2 料液比對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.2 Effects of the rate of liquid to solid on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

由圖2可知，在料液比從1∶5到1∶25范圍內，呈現出先增加后降低的趨勢，料液比從1∶5到1∶10，提取率略有上升，在1∶10時提取率最大，達到55.68%。1∶10之后呈下降趨勢。料液比從1∶15到1∶25時，蛋白質的提取率變化不大。因此，確定水酶法提取辣木籽蛋白質的最佳料液比為1∶10。

圖3 酶添加量對辣木籽蛋白質提取的影響Fig.3 Effects of enzyme amount on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.3.2 酶添加量對辣木籽蛋白質提取率的影響結果

由圖3可知，在酶添加量為2%～4%之間時，提取率逐漸增加，4%時提取率最高為63.70%，當用酶量超過4%時，提取率開始緩慢下降，進一步增加酶用量，提取率略有降低，這可能是因為蛋白質受到酶的過度水解，空間結構受到影響[12]。再者，考慮到酶的價格較高，酶用量過高加大產品的成本，因此選擇最佳酶添加量為4%。

2.3.3 pH對辣木籽蛋白質提取率的影響結果

由圖4可知，pH從8.0增加到9.0，蛋白質提取率也隨之增大，當pH為9時，有最大值59.88%，當pH從9.0增加到10.0時，提取率逐漸降低，這是由于在pH為9時接近于此條件下的最適pH，此時其活性最高，因此選擇最佳pH為9.0。

圖4 pH對辣木籽蛋白質提取率影響Fig.4 Effects of pH on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.3.4 溫度對辣木籽蛋白質提取率的影響結果

由圖5可知，在40～55 ℃時，隨著溫度的提高，番木瓜蛋白質的提取率逐漸增大；當溫度達到55 ℃時，提取率達到最大值59.23%；當溫度超過55 ℃后，提取率隨著溫度的增加而逐漸降低，這主要是由于在超過55 ℃時使其偏離堿性蛋白酶的最適溫度，導致酶的作用變弱，因而提取率降低。因此選擇55 ℃作為最佳溫度。

圖5 溫度對辣木籽蛋白質提取率的影響Fig.5 Effects of temperature on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.3.5 時間對辣木籽蛋白質提取率的影響結果

由圖6可知，在提取時間為2.5～3.0 h時，蛋白質提取率增加較快，之后增加過緩，4 h后增加非常緩慢，到4.5 h達到最大值63.53%，從控制成本角度考慮，時間越久需要的成本越高。綜合考慮后，選擇4.0 h為最佳時間。

圖6 時間對辣木籽蛋白質提取的影響Fig.6 Effects of time on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.4 響應面分析法優化水酶法提取辣木籽蛋白質的工藝

2.4.1 響應面試驗結果與分析

以溫度、加酶量、時間和pH為因素，以蛋白質提取率為試驗指標，響應面中Box-Behnken試驗方案和結果見表2。對表2的數據經回歸擬合后，得到回歸方程：

y=+61.55+2.90X1+2.08X2+1.26X3+1.77X4-0.95X1X2-0.092X1X3-0.42X1X4+0.25X2X3-0.095X2X4+1.45X3X4-1.31X12-1.13X22+0.33X32-1.76X42(其中X1為溫度，X2為加酶量，X3為時間，X4為pH )。

表2 辣木籽蛋白質提取率的響應面設計方案和結果

由Design Expert軟件進行回歸及方差分析結果如表3所示。方差分析可知，模型的F=6.82，P=0.0001，表明實驗所采用的二次模型是極顯著的，在統計學上是有意義的。對該數學模型的回歸系數檢驗可知：因素X1的P值<0.000 1，說明溫度對蛋白質提取率%的影響是極其顯著的。而因素X2、X3、X4的二次方的P值<0.05，說明酶添加量、時間、pH對蛋白質提取率%的影響是顯著的。交互項X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32的P值均大于0.05，所以交互項對提取率沒有顯著影響。對數學模型進行方差分析，結果表明模型的總回歸也極顯著(P<0.01)。對數學模型進行失擬檢驗，顯示其失擬性呈不顯著(P>0.05)，說明該實驗自變量和響應面值之間線性關系顯著，實驗誤差小。由F檢驗可以得到各因素對辣木籽提取率的貢獻率為：X1>X2>X4>X3，即溫度>加酶量>pH >時間。

表3 回歸模型與方差分析結果

注：P<0.05，差異顯著，用*表示；P<0.001，差異極顯著，用**表示。

Note:*P<0.05,significant difference;**P<0.001,extremely significant difference.

2.4.2 響應面分析與最優條件的確定

三維響應面圖是回歸方程的圖形表現形式，可用來預測和檢驗測試變量和響應值與各變量水平之間的相互作用關系。從圖7到圖12可看出，響應面圖形是響應值對應各實驗因素X1、X2、X3、X4所構成的三維空間曲面圖。若曲線越陡峭，則說明該因素對辣木籽蛋白質提取率影響越顯著。向上凸起為三維圖的總體趨勢，說明該數學模型具有最大值，經分析可知，當X1=60，X2=4.5，X3=4.46，X4=9.0時，即溫度為60 ℃、加酶量為4.5%、時間為4.46 h、pH 為9.0時，理論辣木籽蛋白提取率為67.84%，由于試驗條件限制，在X1=60 ℃，X2=4.5%，X3=4.5 h，X4=9.0下對該條件進行驗證試驗，實際測得的結果為68.23%±0.13%，這與理論預測值相差不大，這也說明了該模型可以用于預測辣木籽蛋白質的提取。此實測值高于劉華勇[3]研究的結果，其蛋白質回收率僅為63.69%。

圖7 溫度和酶添加量對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot for temperature and enzymes amount effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

圖8 溫度和時間對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot for time and temperature effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

圖9 溫度和pH對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot for temperature and pH effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

圖10 時間和酶添加量對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plot for enzymes amount and time effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

圖11 酶添加量和pH對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.11 Response surface plot for enzymes amount and pH effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

圖12 時間和pH 對辣木籽蛋白質提取率影響的響應面圖Fig.12 Response surface plot for time and pH effect on the extraction rate of protein from the Moringa oleifera seed

2.5 辣木籽蛋白質氮溶解指數的測定結果

2.5.1 pH對辣木籽蛋白質氮溶解指數的影響

圖13 pH對辣木籽蛋白氮溶解指數的影響Fig.13 Effects of pH on NSI of protein from the Moringa oleifera seed

由圖13可知，辣木籽蛋白在pH=3.0(等電點附近)時，其NSI值最小。蛋白質是兩性分子，在等電點時靜電斥力較弱而導致分子間聚合程度增大，使得大部分蛋白質發生聚集沉淀，故此時NSI值最小。當溶液pH為3.0～8.0時，隨著pH 的增大，靜電斥力也逐漸增大，NSI隨之增大，當pH升到10以后，NSI略有減少。

2.5.2 溫度對辣木籽蛋白質氮溶解指數的影響

由圖14可知，當溫度為 55 ℃時，辣木蛋白的 NSI 達到最大。溫度為25～55 ℃時，NSI隨溫度的升高而增大；隨著溫度的增加，辣木籽蛋白的分子的立體結構伸展，有利于水分子和蛋白質的相互運動，此時蛋白質的氮溶解指數隨著溫度的升高而升高。但當溫度超過55 ℃時，NSI又逐漸降低，此時辣木籽蛋白質分子已經開始變性，蛋白質分子開始發生凝聚和沉淀，使得蛋白質的溶解性發生顯著的下降。

2.6 辣木籽蛋白質持水性的測定結果

2.6.1 pH對辣木籽蛋白質持水性的影響

由圖15可知，當pH值在等電點附近時(pH=3)，辣木籽蛋白的持水力最小，只有0.269 0 g /g。

圖14 溫度對辣木籽蛋白氮溶解指數的影響Fig.14 Effects of temperature on NSI of protein from the Moringa oleifera seed

這是因為在等電點處，蛋白質呈現最弱的水合作用，所以持水力性最差。當pH為3.0～10.0時，蛋白質的持水性逐漸升高，這是因為隨著pH值的升高，蛋白質分子之間的凈電荷和排斥力的增加使蛋白質腫脹而能夠結合較多的水。

圖15 pH對辣木籽蛋白持水性的影響Fig.15 Effects of pH on WHC of protein from the Moringa oleifera seed

2.6.2 溫度對辣木籽蛋白質持水性的影響

由圖16可知，在 30～40 ℃范圍內，辣木籽蛋白的持水能力隨著溫度的升高而升高。在 40～70 ℃范圍內，蛋白質持水能力有所下降，這是因為溫度升高，蛋白質分子開始變性，蛋白質構象也發生了變化，進而致使蛋白質氫鍵作用和離子基團水合作用減弱，導致蛋白質的持水能力降低。

圖16 溫度對辣木籽蛋白持水性的影響Fig.16 Effects of temperature on WHC of protein from the Moringa oleifera seed

2.7 辣木籽蛋白質吸油性的測定結果

蛋白質的吸油性是指蛋白質與游離脂肪相結合的能力。由圖17可知，在55 ℃時，辣木籽蛋白的吸油性最高為2.687 g/g。隨后隨著溫度的升高，辣木籽分離蛋白的吸油性逐漸下降。這是因為蛋白質和脂類之間的作用力是脂類的非極性鏈和蛋白質非極性區間的疏水相互作用，隨著溫度的升高，油的粘度降低，脂類分子的流動性增強，從而降低了與蛋白質的結合，使蛋白質的吸油性降低。

圖17 溫度對辣木籽蛋白吸油性的影響Fig.17 Effects of temperature on oil absorption ability of protein from the Moringa oleifera seed

3 結論

本試驗在單因素試驗基礎上，利用響應面分析法優化了水酶法提取辣木籽蛋白質的工藝條件。得出最佳工藝條件為：使用Alcalase堿性蛋白酶在料液比為1∶10，酶添加量為4.5%，pH為9.0，溫度為60 ℃，時間為4.5 h，此時辣木籽蛋白質的提取率最高為68.23%。四個因素對辣木籽蛋白質提取率的影響為溫度>酶添加量>pH>時間。辣木籽蛋白具有良好的功能特性，如溶解性、持水性、吸油性等。在pH為10、溫度為55 ℃時辣木籽蛋白質的氮溶解指數最高；辣木籽蛋白質持水性隨著pH 的增加而增加，在溫度為40 ℃時持水性最好；在溫度為55 ℃時，辣木籽分離蛋白的吸油效果最明顯。由于辣木渾身都是寶，具有良好的開發應用前景，對辣木籽的高值化綜合開發利用必將帶來良好的經濟效益和社會效益。