拐棗中總黃酮提取工藝優化及其抗黃嘌呤氧化酶活性研究

許洪波，李 鉑，唐志書，李 圓，冀 春,2，劉乃堯,2，吳群軍，王 薇

1陜西中醫藥大學陜西省中藥資源產業化協同創新中心；2陜西中醫藥大學藥學院，咸陽 712083；3旬陽太極緣生物科技有限公司，安康 725741

拐棗，又名萬壽果，為鼠李科枳椇屬枳椇(Hoveniaacerba)的膨大果序軸(肉質果柄)，其上所產種子即為中藥枳椇子[1]。拐棗中含有豐富的維生素、有機酸、氨基酸、糖苷等，是藥食兩用物品；入藥可用于消渴、解煩止嘔等[1,2]。此外，拐棗還具有重要的經濟價值，是飲料、制醋、釀酒的常用原料[3]?，F代化學、藥理學及工藝研究多集中在枳椇子方面[4-8]，很少涉及肉質果柄。

我們前期研究表明，拐棗的50%乙醇提取物對黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)具有明顯的抑制作用，其IC50為82.46 ± 5.39 μg/mL；這也是我們首次發現拐棗具有此活性。化學成分預試實驗提示，該部位主要含有黃酮類化合物。為了闡明該部位體外抗XO的活性物質，本研究選取拐棗為研究對象，首先采用響應面法優化其總黃酮的提取工藝，并在此基礎上進一步富集純化，最后評價所得總黃酮抑制XO的活性；研究結果以期為拐棗食品和天然藥物開發利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

拐棗收集于陜西安康旬陽縣，經陜西中醫藥大學王薇教授鑒定為鼠李科枳椇屬枳椇(HoveniaacerbaLindl.)的肉質果柄(帶少量果實)。蘆丁對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，純度以98.0%計，批號：wkq16101104)；黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤、別嘌呤醇購自成都西亞化工股份有限公司，EDTA-2Na、KH2PO4、K2HPO4和甲醇、乙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-2600 紫外可見分光光度計(日本島津)，EYELA N-1100旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)，HH-2 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，FW-1000AD 型快速開蓋高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)，CPA2250型電子天平(賽多利斯公司，讀數精度0.01 mg)，KQ-300 DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。全波長酶標儀(Multiskan GO,Thermo Scientific,USA)。

2 實驗方法

2.1 樣品前處理

拐棗樣品放置于鼓風干燥箱內，50 ℃條件下干燥至恒重，取出適當粉碎后保存備用。

2.2 標準曲線的繪制

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，以蘆丁為對照品。具體步驟如下：精密稱定20 mg蘆丁對照品于100 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液稀釋并定容至刻度線，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精確吸取對照品溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO溶液1.0 mL，搖勻后靜置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，放置6 min，加入10% NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻后放置15 min。在510 nm處測定各濃度樣品吸光度，以蘆丁濃度(C)和吸光度(A)分別為橫、縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程為：A=5.811 4C+ 0.094 2(R2=0.999 3)，表明所測黃酮在0.02～0.18 mg/mL質量濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系。

2.3 單因素試驗

準確稱取10 g干燥的拐棗粉末，浸泡0.5 h后，在設定的實驗條件下(考察提取次數、料液比、乙醇濃度和提取時間四個因素)回流提取，將提取液過濾，(合并)濾液濃縮至約50 mL，轉移至100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻作為樣品溶液。精密吸取1.0 mL樣品溶液，轉移至10 mL 容量瓶中，再用60% 乙醇定容至刻度，搖勻，按照標準曲線繪制方法操作，測定吸光度，根據標準曲線計算出測定稀釋后樣品溶液總黃酮濃度C。然后計算樣品中總黃酮的提取率，總黃酮提取率計算公式如下：

提取率(%)=[黃酮的質量濃度(mg/mL)×稀釋倍數×最初溶液體積(mL)×10-1]/原料質量(g)

2.4 響應面實驗

在單因素實驗的基礎上，選取料液比(A)、提取時間(B)和乙醇濃度(C)為考察因素，以總黃酮提取率為響應值，根據Box-Benhnken 實驗設計原理，采用三因素三水平的響應面實驗表，用Design Expert 8.0進行試驗數據分析，最后通過模型驗證確認總黃酮最佳提取條件。Box-Benhnken試驗設計因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平表

2.5 總黃酮的富集純化

將經最優工藝提取的提取液，減壓濃縮至無醇味，吸附于適量處理過的D101大孔樹脂色譜柱(10 × 80 cm2)中，先用30%乙醇洗脫至顏色變淺，然后用體積分數70%的乙醇洗脫液進行洗脫，直到流出的洗脫液顏色明顯變淺，將該部分洗脫液收集，濃縮即得純化的拐棗總黃酮。

2.6 抑制黃嘌呤氧化酶活性測試

實驗所用的緩沖溶液、底物溶液、酶液配置參照前期建立的方法[9]，活性測試方法及步驟簡述如下：

精密稱取拐棗總黃酮適量，用緩沖液溶解備用，活性測試使用酶標儀，溶液總體積為100 μL，反應時先依次向96孔板加入樣品20 μL，酶液40 μL，在酶標儀內37攝氏度孵育三分鐘，之后加入底物黃嘌呤40 μL，啟動反應，立即在295 nm處記錄吸收度值(每隔30 s一次)，共計5 min。本實驗設置樣品組(加樣品、底物和酶)、酶組(加底物和酶但不加樣品)、空白組(只加底物和樣品不加酶)和陽性對照組(別嘌呤醇)。抑制率(%)用下列公式計算：抑制率(%)=(ΔA酶-ΔA樣品)/(ΔA酶-ΔA空白)×100。其中ΔA指一定時間內吸光度的差值。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 提取次數對提取率的影響

稱取樣品10 g，設定乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時間2 h，考察提取次數(1、2、3、4 次)對總黃酮提取率的影響。由于朱新鵬[10]等研究表明，拐棗總黃酮在溫度大于80 ℃時，穩定性較差，因此，本研究固定提取溫度為80 ℃。實驗結果表明(圖1A)，提取次數越多提取率越大，但提取2次后提取率增加不明顯?？紤]到時間和經濟成本，選取提取次數為2次。

3.1.2 料液比對提取率的影響

稱取樣品10 g，固定乙醇濃度60%，提取溫度80 ℃，回流提取兩次，每次提取2 h，考察料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時對提取率的影響。結果如圖1B 所示，隨著提取溶劑量的增加，黃酮提取率呈現先快速增長而后下降的趨勢。增加提取溶劑用量，可以使物料與溶劑充分接觸，同時可以使更多的物質溶解于溶液中，從而有助于提升總黃酮的提取率。但本試驗結果表明，當料液比超過1∶15 g/mL時，總黃酮提取率趨于平緩，超過1∶20 g/mL時反而有所下降，這可能是由于溶劑過多，在熱回流作用下，拐棗中非黃酮類成分大量溶出，影響了總黃酮的得率?？紤]到溶劑成本，選擇1∶15 g /mL為適宜料液比。

3.1.3 乙醇濃度對提取率的影響

取樣品10 g，分別以40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比1∶20，回流提取兩次，每次2 h，提取溫度為80 ℃，考察乙醇濃度對拐棗總黃酮提取率的影響。結果如圖1C 所示，提取率隨乙醇濃度遞增呈先增加后減少的變化趨勢，在乙醇濃度為50%左右時，總黃酮的提取率較好。這可能的原因是：黃酮類化合物在植物中通常以苷的形式存在，我們推測拐棗中黃酮苷類物質較多，因此，50%左右的乙醇提取效果較好，隨著乙醇濃度增大，一些醇溶性雜質成分溶出量增加，反而導致黃酮類化合物的提取率下降。

3.1.4 提取時間對提取率的影響

取樣品10 g，設定乙醇濃度60%，回流提取兩次，提取溫度80 ℃，每次分別回流提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察提取時間對總黃酮提取率的影響。圖1D 顯示提取時間在1～1.5 h之間，提取時間對拐棗總黃酮提取率的總體影響不大，提取時間超過2 h后提取率反而減少了。這可能是提取時間增長，一方面某些黃酮類化合物可能發生結構變化，另一方面可能因為隨著提取時間的增長，植物細胞中的粘液等雜質溶出使提取液粘度增大，影響提取率。

圖1 提取次數(A)、料液比(B)、乙醇濃度(C)及提取時間(D)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of number of extractions (A),solid-to-liquid ratio (B),ethanol concentration (C) and extraction time (D) on the yield of total flavonoids

3.2 響應面設計試驗結果及分析

在單因素試驗基礎上，固定提取次數和提取溫度，以料液比(A)、乙醇濃度(B)、提取時間(C)為自變量，以總黃酮提取率為響應值，設計17次試驗，其中析因部分試驗12次，中心點重復試驗5次，結果見表2。試驗以隨機次序進行，利用Design Expert 8軟件對數據進行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率Y的函數:Y=2.52 + 0.016A- 0.13B+ 0.30C+ 0.027AB- 0.050AC+ 0.087BC- 0.33A2- 0.20B2- 0.51C2。

模型中一次項B和C，二次項A2、B2和C2的P值均小于0.01，交互項BC的P值小于0.05，說明提取時間、乙醇濃度、提取時間的交互項以及3個因素的二次項都具有顯著影響；而其他交互項和料液比的顯著性較差，表明實驗因素對響應值不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系[11]。

響應曲面坡度越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變越敏感，反之曲面坡度越平緩，操作條件的改變對響應值的影響也就越小。圖2直觀的反映了各因素對響應值的影響程度，乙醇濃度對拐棗總黃酮提取率的影響最為顯著，表現為曲線較陡，其次為提取時間和料液比，表現為曲線較平緩。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸方程的方差分析

注:**P< 0.01為極顯著;*P< 0.05為顯著。

Note:**P< 0.01,indicates extremely significant difference;*P< 0.05,indicates significant difference.

圖2 各提取因素之間的交互影響Fig.2 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of flavones

3.3 最佳工藝條件及驗證試驗

用Design Expert 8軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得到最佳的提取條件為：料液比為14.96 mL/g、提取時間1.86 h、乙醇濃度52.76%，預測提取率為2.58%。但考慮到實際操作和生產的局限性，將提取工藝調整為∶料液比為15.0 mL/g、提取時間1.85 h、乙醇濃度53.0%。根據此條件并在浸泡0.5 h，提取溫度80 ℃，提取2次條件下進行了3次平行驗證實驗，得到拐棗總黃酮的平均提取率為2.56%，相對標準偏差為1.74%，表明試驗重復性良好。驗證結果與模型的預測值接近，表明此響應面法得到的回歸模型具有較好的可靠性。

3.4 拐棗總黃酮的進一步富集純化

上述工藝優化所得的物質其實是含有拐棗總黃酮的提取物，優化的目的只是使總黃酮盡可能的提取出來，但其在提取物中的含量比較低；因此，我們需要進一步富集純化，得到含量較高的拐棗總黃酮，以進行后續研究。

經過2.5項下方法富集純化后，拐棗提取物總黃酮純度達到63.15%。

3.5 體外抑制黃嘌呤氧化酶活性測試

黃嘌呤氧化酶是一種可催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸的蛋白酶[12]。正常人體中XO活性被調控在正常水平，但體內代謝紊亂，就可能導致XO活性過高，會使體內尿酸生成增加，進而導致高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)[13,14]。HUA不僅與痛風密切相關，而且是代謝性疾病(糖尿病、代謝綜合征、高脂血癥等)、心血管疾病、慢性腎病、腦卒中等的獨立危險因素[15]。臨床上通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，從而減少尿酸生成是治療HUA 的重要途徑之一。但臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑(xanthine oxidase inhibitors,XOI)主要有兩個，即別嘌呤醇(allopurinol)和非布司他(febuxostat)，它們雖然可明顯降低血尿酸水平，但也有存在較多副作用和局限性。目前，由于中藥具有多成分，多靶點，低毒、有效等特點，因此從中藥中尋找天然XOI具有特殊的優勢。

我們前期對拐棗的50%乙醇提取物進行了活性篩選，首次發現拐棗50%乙醇提取物具有明顯的抗XO活性，其IC50為82.46 ± 5.39 μg/mL。本研究在此基礎上，主要考察拐棗總黃酮在體外對XO的抑制作用?；钚栽囼灢捎们捌跇嫿ǖ幕钚詼y試方法[9]，測試了拐棗總黃酮在6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL濃度時對XO的抑制作用(圖3)，結果表明拐棗總黃酮在25 μg/mL時即對XO有明顯抑制，抑制率為(75.36 ± 3.97)%；經GraphPad Prism 5 軟件計算其IC50為18.63 ± 1.67 μg/mL，陽性對照別嘌醇的IC50為7.24 ± 0.33 μg/mL。活性研究結果表明，黃酮類成分可能是拐棗50%乙醇提取物中具有抗XO活性的物質。

圖3 拐棗總黃酮抑制黃嘌呤氧化酶的量效關系曲線Fig.3 The dose-effect relationship curve for total flavonoids of Hovenia acerba inhibiting XO

4 結論

本研究利用響應面法設計優化拐棗總黃酮的提取工藝，得到最佳工藝條件為：料液比為15.0 mL/g、提取時間1.85 h、乙醇濃度53.0%，在此條件下預測提取率為2.58%，實際提取率為2.56%，理論值與實際值相符，表明試驗可靠。本模型可用于拐棗黃酮的提取制備，可為拐棗黃酮的工業化、規?；_發利用提供參考。

體外抗XO活性結果表明，拐棗總黃酮具有顯著的抗XO活性，其IC50為18.63 ± 1.67 μg/mL，活性研究結果提示，拐棗黃酮可能是拐棗50%乙醇提取物中具有抗XO活性的物質。本研究可為從拐棗中尋找和發現天然抗XO活性分子提供參考，同時可為拐棗的開發利用提供思路。