灰毛豆內生真菌淡紫擬青霉菌(TPL04)代謝產物的研究

李 葉，劉 勝，張 凱，張 瑤，李有志,2，丁文兵,2 *

1湖南農業大學植物保護學院；2國家植物功能成分利用工程技術研究中心，長沙 410128

淡紫擬青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)是一種內寄生性真菌，最早分離于秘魯根結線蟲卵囊，分布世界各地，且寄主廣泛、培養簡單[1]。淡紫擬青霉菌在防治植物病原線蟲效果顯著，目前活菌體已投入生產使用；可侵染半翅目、同翅目、鱗翅目害蟲；在防治植物病原菌方面也有良好效果；還能產生類生長素促進植物生長；對難溶磷酸鹽類農藥也有降解作用[2]。本實驗室前期已對灰毛豆內生真菌進行系統地分離鑒定[3]，而其中的活性菌株TPL04鑒定為淡紫擬青霉菌(P.lilacinum)。雖然淡紫擬青霉對生長條件要求較低，但不同的寄主來源會使其次生代謝物發生較大變化。如土壤及多種植物根系來源的菌株已闡明的主要化合物類型有：甾體、脂肪酸、酚酸、倍半萜、吲哚乙酸類似物等[4,5]；而來自海洋環境的菌株則還能產鞘氨醇類、甘油酯類、吡喃酮類、環己稀酮類等化合物[6]。鑒于本研究中的菌株TPL04來自灰毛豆葉片，其次生代謝產物尚不清楚。本文對該內生菌株(TPL04)進行液體發酵，對其發酵產物化學成分進行分離、鑒定及單體化合物抑菌活性測定。共分離得到8個單體化合物，結構分別鑒定為5-羥基己酸-4-內酯(1)、(R)-4-芐基-2-噁唑烷酮(2)、2′-脫氧胸苷(3)、對羥基苯甲酸甲酯(4)、光色素(5)、β-胡蘿卜苷(6)、尿嘧啶核苷(7)、己六醇(8)，其中化合物4對四種植物病原菌的生長有抑制活性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

潔凈工作臺(SW-CJ-1BU，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；高壓滅菌鍋 (TOMY SX-500，上海田源技術有限公司)；恒溫培養振蕩器(HNY-211C，天津市歐諾儀器儀表有限公司)；光照培養箱(GZX-250BS-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司)；旋轉蒸發儀(EYEL4N-1001，上海愛朗儀器有限公司)；薄層層析硅膠(煙臺江友硅膠開發有限)；玻璃點樣毛細管(華西醫科大學儀器廠生產)；萬用電爐(北京科偉永興儀器有限公司生產)；三用紫外線分析儀(ZF-6，上海嘉鵬科技有限公司)；正相柱層析硅膠：200-300目硅膠、拌樣硅膠：60-100目硅膠(青島海洋化工有限公司)；數控超聲波清洗器(KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司)；拌樣反相硅膠(ODS C18，日本Nomura公司)；半制備型高壓輸液泵[SP-5030，賽譜銳思(北京)]；高效液相色譜儀(HPLC)：Waters 1525串2414檢測器(美國Waters 公司)，半制備型色譜柱型號YMC-Pack ODS-A(日本島津公司，250 mm × 10 mm I.D.;S-5 μm,12 nm)；超純水(Mill-Q超純水機制)；Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠(瑞士Amersham生物科學公司)；自動部分收集器(BS-100N，上海滬西分析儀器有限公司)；厚制備板(煙臺江友硅膠開發有限公司)；有機試劑：甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純(天津恒興化學試劑制造有限公司生產)。

1.2 培養基

固體培養基為PDA培養基(取去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL)；液體培養基為PDB培養基(取去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL)[7]。以上培養基需在121 ℃、高壓滅菌20 min，待降溫降壓后取出。

1.3 菌株

菌株TPL04源于實驗室前期成果，分離自灰毛豆葉片，經過生態學和形態學鑒定后，確定其為淡紫擬青霉菌(Purpureocilliumlilacinum)[3]現保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M 2017408。

2 實驗方法

2.1 菌株的發酵及其次生代謝產物的提取

菌株液體發酵條件：將斜面保藏的菌株轉接至馬鈴薯-瓊脂(PDA)平板上進行活化，26 ℃培養5～7天后接種至裝有200 mL馬鈴薯液體(PDB)培養基的500 mL錐形瓶中，溫度為28 ℃，轉速為12 000 rpm，發酵周期為7～10天，共收集100 L發酵液。

發酵結束后，用8層紗布過濾，濾液用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3遍，經旋轉蒸發儀旋干后得粗提物；菌絲用甲醇提取3遍，經減壓蒸干后得粗提物，合并三種粗提物得總浸膏48.4 g。

2.2 分離

取上述浸膏45 g，用60～100目硅膠拌樣，經正相硅膠柱(200～300目)采用石油醚/丙酮(9∶1、8∶2、7∶3，v/v)和氯仿/甲醇(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4，v/v)，依次梯度洗脫后經TLC檢測合并得4個主流份(Fr.A1～A4)。A1(共169 mg)經凝膠Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫得Fr.A1-1，經制備薄層色譜法，以石油醚/丙酮(7∶3)為展開劑得Fr.A1-1-1，通過HPLC制備，甲醇/水(50∶50，v/v)洗脫，流速為3 mL/min，得到化合物1(2.6 mg，Rt=13.5 min)和2(10.5 mg，Rt=18.0 min)。將Fr.A2(1.74 g)采用ODS C18柱層析法，以甲醇/水(30%→90%，v/v)洗脫，經TLC檢測合并得4個亞組份Fr.A2-(1～4)；Fr.A2-1 經凝膠Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫得Fr.A2-1-1，經制備薄層色譜法，以氯仿/甲醇/水(7∶3∶1)為展開劑得Fr.A2-1-1-1，通過HPLC制備，甲醇/水(30∶70，v/v)洗脫，流速為3 mL/min，得到化合物3(4.5 mg，Rt=21.4 min)；Fr.A2-2，經制備薄層色譜法，以氯仿/甲醇(9∶1)為展開劑得Fr.A2-2-2，通過HPLC制備，甲醇/水(50∶50，v/v)洗脫，流速為3 mL/min，得到化合物4(1.3 mg，Rt=28.7 min)；Fr.A2-3中有較純的主點，沉淀用純甲醇清洗，得化合物5(0.9 mg)，為淡黃色粉末；Fr.A2-4為白色沉淀，通過純甲醇清洗得化合物6(2.9 mg)。Fr.A3(0.78 g)經凝膠Sephadex LH-20柱層析，以甲醇洗脫得Fr.A3-1，經制備薄層色譜法，以氯仿/甲醇/水(7∶3∶1)為展開劑得化合物7(16.1 mg)。Fr.A4(4.84 g)采用ODS C18柱層析法，以甲醇/水(30%→90%，v/v)洗脫，得Fr.A4-1，重結晶(甲醇/水)得白色針狀晶體8(12.2 mg)。

2.3 單體化合物的抑菌活性測定

采用含毒介質法[8]。

毒培養基的制備：稱取所需樣品量，溶解于甲醇，加入吐溫80乳化后，用無菌水配制成所需濃度的藥液；PDA冷卻至50～60 ℃，在無菌條件下，將藥液與培養基以1∶9混合，得到含毒培養基。

將約7 mm的病原真菌菌餅接至含毒培養基和溶劑對照培養基上，設3個重復，5個濃度梯度。觀察菌落生長情況，測量菌落直徑，以M=(A-C)/A×100%(M為抑菌率，A為對照組的菌落直徑，C為處理組的菌落直徑)求出抑菌率，用SPSS軟件算出對應的線性回歸方程和EC50。

3 實驗結果

3.1 結構鑒定

化合物1棕色油狀，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:4.38 (1H,m,H-4),3.92 (1H,m,H-5),2.52 (2H,t,J=8.0 Hz,H-2),2.19 (2H,m,H-3),1.14 (3H,d,J=6.5 Hz,H-6)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:180.5 (s,C-1),85.7 (d,C-4),68.9 (d,C-5),29.5 (t,C-2),22.8 (t,C-3),18.8 (q,C-6)；ESI-MSm/z153 [M+Na]+,283 [2M+Na]+,295 [2M+Cl]-。以上數據與文獻[9]數據比對基本一致，故鑒定該化合物為5-羥基己酸-4-內酯(5-Hydroxyhexan-4-olide)。

化合物3白色晶體，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.79 (1H,d,J=0.9 Hz,H-6),6.25 (1H,t,J=6.8 Hz,H-1′),4.38 (1H,m,H-3′),3.88 (1H,m,H-4′),3.77 (1H,dd,J=12.0,3.2 Hz,H-5a′),3.70 (1H,dd,J=12.0,3.6 Hz,H-5b′),2.20 (2H,m,H-2′),1.85 (3H,s,CH3-5)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.6 (s,C-2),152.6 (s,C-4),138.3 (d,C-6),111.7 (s,C-5),89.0 (d,C-4′),86.4 (d,C-1′),72.4 (d,C-3′),63.0 (t,C-5′),41.3 (t,C-2′),12.6 (q,5-Me)；ESI-MS m/z 265 [M+Na]+,241 [M-H]-,277 [M+Cl]-。結合文獻[11]確定化合物3為2′-脫氧胸苷 (2′-Deoxythymidine)。

化合物4白色固體粉末，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,DMSO)δ:7.83 (2H,d,J=8.8 Hz,H-2,H-6),6.79 (2H,d,J=8.8 Hz,H-3,H-5),3.82 (3H,s,OCH3);13C NMR (150 MHz,DMSO)δ:168.9 (s,C-7),163.9 (s,C-4),132.9 (d,C-2,5),122.2 (s,C-1),116.4 (d,C-3,6),52.4 (q,OCH3)；ESI-MSm/z305 [2M+H]+,151 [M-H]-,187 [M+Cl]-。以上數據與文獻[12]報道數據一致，故此鑒定為對羥基苯甲酸甲酯 (Methylparaben)。

化合物5黃色固體粉末，溶于DMSO；1H NMR (600 MHz,DMSO)δ:11.84 (1H,s,NH-3),11.67 (1H,s,NH-1),7.91 (1H,s,H-6),7.71 (1H,s,H-9),2.48 (3H,s,H-12),2.46 (3H,s,H-11)；13C NMR (150 MHz,DMSO)δ:160.6 (s,C-4),150.0 (s,C-2),146.4 (s,C-10a),144.6 (s,C-7),141.6 (s,C-9a),138.8 (s,C-8),138.3 (s,C-5a),130.2 (s,C-4a),128.7 (d,C-6),125.8 (d,C-9),20.2 (q,C-12),19.5 (q,C-11)；ESI-MSm/z256 [M+Na]+,241 [M-H]-,277 [M+Cl]-。以上數據與文獻[13]報道數據對照基本一致，故此鑒定為光色素 (Lumichrome)。

化合物6白色粉末(氯仿/甲醇)，溶于吡啶；無紫外吸收，碘氧化顯色，5% 硫酸-乙醇噴霧加熱顯色紫紅色；氯仿-甲醇9∶1展開Rf=0.5，其與β-胡蘿卜苷對照品對照，經3種溶劑系統展開后，在同Rf值處有同樣紫色斑點，混合點樣后展開為單一斑點；熔點mp：295～296 ℃，與對照品混合后測熔點不下降，鑒定化合物為β-胡蘿卜苷 (β-Daucosterin)。

化合物7黃色油膏狀物，易溶于甲醇；1H NMR (600 MHz,CD3OD)δ:7.99 (1H,d,J=8.1 Hz,H-6),5.88 (1H,d,J=4.7 Hz,H-1′),5.68 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5),4.15 (1H,m,H-3′),4.13 (1H,m,H-2′),3.99 (1H,m,H-4′),3.82 (1H,dd,J=12.2,2.7 Hz,H-5b′),3.71 (1H,dd,J=12.2,3.1 Hz,H-5a′)；13C NMR (150 MHz,CD3OD)δ:166.3 (s,C-4),152.6 (s,C-2),142.9 (d,C-6),102.8 (d,C-5),90.9 (d,C-1′),86.5 (d,C-4′),75.9 (d,C-3′),71.5 (d,C-2′),62.4 (t,C-5′)。以上結果并結合文獻[14]確定此化合物為尿嘧啶核苷 (Uridine)。

化合物8白色針狀晶體，易溶于水，微溶于氯仿甲醇混合溶劑；1H NMR (600 MHz,D2O)δ:3.74 (2H,dd,J=11.8,2.8 Hz,H-1a,H-6a),3.67 (2H,d,J=8.6 Hz,H-3,H-4),3.62 (2H,m,H-2,H-5) 3.54 (2H,dd,J=11.8,6.2 Hz,H-1b,H-6b)；13C NMR (150 MHz,D2O)δ:70.8 (d,C-2,5),69.2 (d,C-3,4),63.2 (t,C-1,6)；ESI-MSm/z205 [M+Na]+,181 [M-H]-。以上數據與文獻[15]比對基本一致，故化合物鑒定為己六醇 (Hexitol)。

圖1 化合物1～8的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

3.2 抑菌活性

設置化合物處理濃度為400 mg/L時，僅化合物4表現出對四種植物病原菌：水稻紋枯菌(Pelliculariasasakii)、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)、草莓灰霉菌(Botrytiscinerea)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)有較強的抑制活性，其抑制率分別為100%、100%、100%、94.12%。重新設置濃度梯度后，根據結果算出抑菌率，并將數據輸入SPSS軟件中，求出線性回歸方程和對應的EC50為54.619、78.084、109.315、179.548 mg/L，結果如表1所示。

表1 化合物4對四種植物病原菌的抑制活性

注：EC50的單位為mg/L。

Note:EC50in mg/L.

4 討論

植物內生真菌(endophytic fungus)存在于植物根、莖、葉等組織器官中，通常能與植物保持共生關系，參與并影響寄主植物代謝產物的種類或含量，少數還能產生相同或類似的化合物[16]。本文從灰毛豆葉片內生真菌TPL04發酵產物中分離鑒定了8個化合物，其中化合物2與灰毛豆葉片中的成分(S)-4-芐基-2-噁唑烷酮互為構型異構體[17]，表明菌株TPL04與寄主植物灰毛豆在次生代謝產物的合成方面存在一定的聯系。淡紫擬青霉菌(Purureocilliumlilacinum)還是重要的生防殺菌劑，已有研究表明其發酵液能抑制玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、水稻紋枯病菌(Rhizoctomiasolani)等植物病原菌生長[18]；淡紫擬青霉菌中的多糖及蛋白性質抗生素對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)有顯著拮抗作用，能抑制尖孢鐮刀菌孢子的生成、萌發與菌落生長[19]。本研究進一步發現該菌株的次生代謝成分對羥基苯甲酸甲酯(4)對水稻紋枯菌、辣椒疫霉菌、草莓灰霉菌、油菜菌核菌有抑菌活性，為淡紫擬青霉菌的開發利用奠定了化學物質基礎。