離舌橐吾中艾里莫酚烷型倍半萜類化學成分的研究

徐健龍，鄒 坤，楊 迪，李文聰，喬 婷，盧 穎，程 凡，王 慧

三峽大學生物與制藥學院 天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，宜昌 443002

菊科(Asteraceae)橐吾屬(Ligularia)植物大約有150種，主要分布于亞洲，其中超過100種分布于中國各地區[1]。離舌橐吾L.veitchiana為菊科橐吾屬植物，主要分布于云南西北部、四川、貴州、湖北西部、甘肅西南部、陜西南部等地，生于海拔1 400～3 300米的河邊、山坡及林下；其味辛、苦，性溫，入肺經，具有潤肺下氣、清熱解毒、抗菌消炎、化痰止咳、活血止痛等功效；在民間主要用作治療流行性感冒、咳嗽、潰瘍和肺結核等癥[2-3]。據文獻報道，離舌橐吾化學成分主要為艾里莫酚烷型倍半萜類、苯并呋喃類和三萜類等化合物[3]。為了進一步研究離舌橐吾中艾里莫酚烷型倍半萜類化合物，本課題組對其醇提物乙酸乙酯部位進行了系統分離，從中分離得到13個艾里莫酚烷型倍半萜類化合物，分別鑒定為：eremophilenolide(1)，eremophila-7(11),9-dien-8-one(2)，eremophil-6-en-11-ol(3)，8-oxo-eremophil-6-en-11-one(4)，(6α,8α)-6-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8-olide(5)，8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(6)，6β-hydroxy-8α-methoxyeremophil-7(11)-12,8β-olide(7)，2α-hydroxyeremophil-11-en-9-one(8)，6β-methoxy-8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(9)，6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide(10)，6β-hydroxy-8β-methoxyeremophil-7(11)-12,8α-olide(11)， 6β,8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide(12)和6β,8α-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide(13)。其中，化合物5和10互為非對映異構體，化合物7和11為一對非對映異構體，化合物12和13為一對非對映異構體。除化合物3和5外，其余化合物均為首次從該植物中分離得到。

圖1 化合物1～13的化學結構Fig.1 Chemical Structures of compounds 1-13

1 材料

1.1 儀器與材料

Bruker AV 400 核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司)；Thermo Scientific ISQ LT單四極桿質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀(美國戴安公司)；LC-6AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×10 mm，10 μm，半制備型；250 mm×4.6 mm，5 μm，分析型，日本 YMC公司)；AL204-IC 電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；低溫冷凍干燥機(美國Labconco公司)；正相色譜硅膠(青島海洋化工有限公司)；反相色譜硅膠(日本YMC公司)。薄層色譜硅膠板 GF254(青島海洋化工廠)；高效液相用甲醇、乙腈均為色譜純(美國TEDIA公司)，其他試劑均為分析純(天津科密歐化學試劑有限公司)。

離舌橐吾藥材于2015年7月采自湖北省神農架林區，經三峽大學生物與制藥學院王玉兵博士鑒定為離舌橐吾L.veitchiana，植物標本(LV201510)存放于三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室。

1.2 細胞株

胃癌細胞HGC-27和宮頸癌細胞Caski均由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室提供。

2 提取分離

取自然干燥的離舌橐吾藥材1.45 kg，剪碎，用95%乙醇冷浸提取3次、每次48 h。提取液合并后減壓蒸干。提取物經水混懸后，依次用石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將乙酸乙酯部位進行正相硅膠柱(200～300目)分離，以氯仿：甲醇(100∶0→1∶1)梯度洗脫，得Fr.1～127。TLC分析后，合并Fr.12-16(301.3 mg)，進行高效液相色譜半制備分離純化(乙腈-水=58∶42，2.5 mL/min)，得到化合物1(3.8 mg)、2(10.3 mg)、3(3.9 mg)；合并Fr.19-26(173.1 mg)，進行高效液相色譜半制備分離純化(乙腈-水=56∶44，2.5 mL/min)，得到化合物4(3.7 mg)；合并Fr.28-31，經反相硅膠柱(甲醇-水∶10%→100%)分離，得Frr.1～70，合并Frr.36-39(223.5 mg)，經半制備柱制備(乙腈-水=47∶53，2.5 mL/min)，得到化合物5(8.8 mg)、6(7.1 mg)、7(18.1 mg)和8(2.8 mg)；合并Frr.33-35(550.9 mg)，經兩次半制備柱制備(乙腈-水=42∶58，2.5 mL/min)，得到化合物5(44.4 mg)、9(10.1 mg)、10(14.9 mg) 和11(36.3 mg)；合并Fr.34-37(932.6 mg)，經凝膠柱分離(甲醇∶氯仿=1∶1)，得Frr.1～57，合并Frr.25-29(359.8 mg)，經半制備柱制備(乙腈-水=55∶45，2.5 mL/min)，得到化合物12和13的混合物(共192.4 mg)。

3 結構鑒定

化合物1無色固體(CHCl3)；EI-MS：m/z234 [M]+，分子式C15H22O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.79(3H，d，J=6.5 Hz，15-CH3)，1.04(3H，s，14-CH3)，1.25(1H，m，H-3a)，1.35(1H，m，H-1b)，1.44(1H，m，H-3b)，1.46(2H，m，H-2)，1.62(1H，m，H-4)，1.68(1H，m，H-10)，1.74(1H，dd，J=13.2，10.8 Hz，H-9b)，1.81(3H，t，J=1.6 Hz，13-CH3)，1.85(1H，m，H-6b)，1.88(1H，m，H-1a)，2.09(1H，ddd，J=11.7，6.8，3.0 Hz，H-9a)，2.90(1H，d，J=13.8 Hz，H-6a)，4.64(1H，m，H-8)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.3(C-13)，16.1(C-15)，20.6(C-2)，21.7(C-14)，26.7(C-1)，30.0(C-4)，30.7(C-3)，35.1(C-9)，36.5(C-6)，39.9(C-5)，40.2(C-10)，80.5(C-8)，120.6(C-11)，161.3(C-7)，175.1(C-12)。以上數據與文獻[5]對照基本一致，故確定化合物1為eremophilenolide。

化合物2無色油狀物(CHCl3)；EI-MS：m/z218 [M]+，分子式C15H22O；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，0.97(3H，s，14-CH3)，1.83(3H，s，13-CH3)，2.09(3H，d，J=2.0 Hz，12-CH3)，5.74(1H，dd，J=1.7，0.7 Hz，H-9)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：15.4(C-15)，16.0(C-14)，22.0(C-12)，22.5(C-13)，26.5(C-2)，30.5(C-1)，32.5(C-3)，41.0(C-6)，41.8(C-5)，42.5(C-4)，126.1(C-9)，128.1(C-7)，142.2(C-11)，168.7(C-10)，192.3(C-8)。以上數據與文獻[6]對照基本一致，故確定化合物2為eremophila-7(11),9-dien-8-one。

化合物3無色油狀物(CHCl3)；EI-MS：m/z222 [M]+，分子式C15H26O；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.87(3H，d，J=6.4 Hz，14-CH3)，0.91(3H，s，15-CH3)，1.11(1H，m，H-8)，1.13(3H，s，12-CH3)，1.14(3H，s，13-CH3)，1.20(1H，m，H-3)，1.32(1H，m，H-10)，1.39(1H，m，H-1)，1.50(1H，m，H-3)，1.56(1H，m，H-4)，1.66(1H，m，H-1)，1.71(1H，m，H-8)，1.95(1H，m，H-2)，1.96(1H，m，H-9)，1.99(1H，m，H-2)，2.25(1H，m，H-9)，5.32(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.0(C-14)，21.1(C-15)，25.1(C-2)，26.3(C-12)，26.7(C-1)，27.1(C-3)，27.5(C-13)，28.0(C-9)，34.0(C-4)，35.2(C-8)，37.7(C-5)，41.9(C-10)，72.8(C-11)，120.6(C-6)，143.8(C-7)。以上數據與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物3為eremophil-6-en-11-ol。

化合物4黃色油狀物(CHCl3)；EI-MS：m/z240 [M]+，分子式C14H20O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.95(3H，d，J=6.8 Hz，14-CH3)，1.18(3H，s，13-CH3)，1.36(1H，m，H-3a)，1.38(1H，m，H-1b)，1.46(1H，m，H-3b)，1.49(1H，m，H-2a)，1.58(1H，m，H-2b)，1.75(1H，m，H-1a)，1.85(1H，m，H-4)，2.09(1H，m，H-10)，2.31(1H，dd，J=17.0，4.3 Hz，H-9b)，2.47(3H，s，12-CH3)，2.74(1H，m，H-9a)，7.50(1H，s，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：16.0(C-14)，20.2(C-13)，20.3(C-2)，26.9(C-1)，30.2(C-3)，30.8(C-12)，35.6(C-4)，39.4(C-10)，39.7(C-5)，40.5(C-9)，137.0(C-7)，166.6(C-6)，197.7(C-8)，198.5(C-11)。以上數據與文獻[5]對照基本一致，但文獻未對此化合物進行命名，根據系統命名法，將化合物4命名為8-oxo-eremophil-6-en-11-one。

化合物5無色晶體(CHCl3)；EI-MSm/z：250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=6.3 Hz，15-CH3)，1.11(3H，s，14-CH3)，1.85(3H，d，J=1.6 Hz，13-CH3)，4.69(1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，5.10(1H，ddd，J=10.6，6.9，1.8 Hz，H-8)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.2(C-15)，16.3(C-14)，20.0(C-2)，25.8(C-1)，29.5(C-4)，30.6(C-3)，33.8(C-10)，35.0(C-9)，42.9(C-5)，70.0(C-6)，78.4(C-8)，121.7(C-11)，161.4(C-7)，174.7(C-12)。以上數據與文獻[7]對照基本一致，故確定化合物5為(6α,8α)-6-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8-olide。

化合物6無色晶體(CHCl3)；EI-MS：m/z250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.79(3H，d，J=6.4 Hz，15-CH3)，1.05(3H，s，14-CH3)，1.80(3H，d，J=1.6 Hz，13-CH3)，2.12(1H，m，H-9b)，2.77(1H，d，J=13.7 Hz，H-9a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.3(C-13)，16.0(C-15)，20.5(C-2)，21.5(C-14)，26.2(C-1)，29.6(C-4)，30.5(C-3)，35.0(C-6)，39.0(C-9)，39.5(C-10)，40.4(C-5)，103.9(C-8)，122.6(C-11)，159.1(C-7)，172.5(C-12)。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物6為8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物7無色晶體(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.80(3H，s，14-CH3)，1.00(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，3.18(3H，s，8-OMe)，4.97(1H，dd，J=5.0，2.2 Hz，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.9(C-13)，15.6(C-15)，18.4(C-14)，20.0(C-2)，28.1(C-1)，28.6(C-3)，31.7(C-4)，35.9(C-10)，37.6(C-9)，45.6(C-5)，50.1(OMe)，70.7(C-6)，106.9(C-8)，126.3(C-11)，158.7(C-7)，171.9(C-12)。本文首次采用CDCl3為溶劑，得到了該化合物的13CNMR數據，其結構與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物7為6β-hydroxy-8α-methoxyeremophil-7(11)-12,8β-olide。

化合物8無色晶體(CHCl3)；EI-MS：m/z236 [M]+，分子式C15H24O2；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.80(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，1.03(3H，s，14-CH3)，1.75(3H，s，13-CH3)，4.06(1H，d，J=6.0 Hz，H-2)，4.74(1H，s，H-12a)，4.79(1H，s，H-12b)；13C NMR (CDCl3，100 MHz)δ：15.0(C-15)，20.6(C-13)，21.5(C-14)，26.5(C-1)，27.2(C-4)，37.8(C-3)，39.7(C-7)，41.2(C-5)，42.0(C-6)，46.5(C-8)，56.1(C-10)，65.3(C-2)，109.8(C-12)，147.3(C-11)，216.8(C-9)。本文首次采用CDCl3為溶劑，得到了該化合物的1H NMR和13C NMR數據，其結構與文獻[10]對照基本一致，故確定化合物8為2α-hydroxyeremophil-11-en-9-one。

化合物9無色晶體(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.78(3H，d，J=5.4 Hz，15-CH3)，1.10(3H，s，14-CH3)，1.91(3H，s，13-CH3)，2.08(2H，m，H-9)，3.36(3H，s，OCH3)，4.11(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：8.4(C-13)，16.1(C-15)，16.3(C-14)，20.0(C-2)，25.5(C-1)，29.3(C-4)，30.4(C-3)，34.4(C-10)，39.2(C-9)，43.1(C-5)，58.4(OCH3)，80.7(C-6)，103.7(C-8)，127.0(C-11)，153.9(C-7)，171.1(C-12)。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物9為6β-methoxy-8β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物10無色晶體(CHCl3)；EI-MS：m/z250 [M]+，分子式C15H22O3；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.81(3H，s，14-CH3)，1.01(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，2.06(3H，d，J=2.0 Hz，13-CH3)，4.80(1H，m，H-8)，5.07(1H，s，H-6)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.2(C-15)，19.0(C-14)，20.2(C-2)，28.4(C-1)，28.4(C-3)，31.8(C-4)，35.3(C-10)，35.9(C-9)，44.8(C-5)，71.4(C-6)，77.5(C-8)，122.2(C-11)，162.6(C-7)，175.0(C-12)。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物10為6β-hydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide。

化合物11無色油狀物(CHCl3)；EI-MS：m/z280 [M]+，分子式C16H24O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：0.76(3H，d，J=6.1 Hz，15-CH3)，1.09(3H，s，14-CH3)，1.88(3H，s，13-CH3)，2.74(1H，d，J=9.8 Hz，6-OH)，3.29(3H，s，8-OCH3)，4.51(1H，d，J=9.1 Hz，H-6a)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ:8.7(C-13)，16.2(C-15)，16.3(C-14)，19.9(C-2)，25.6(C-1)，29.5(C-4)，30.6(C-3)，33.4(C-10)，36.5(C-9)，43.4(C-5)，51.1(OCH3)，70.8(C-6)，106.5(C-8)，126.2(C-11)，154.2(C-7)，171.1(C-12)。本文首次采用CDCl3為溶劑，得到了該化合物的13CNMR數據，其結構與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物11為6β-hydroxy-8β-methoxyeremophil-7(11)-12,8α-olide。

化合物12無色晶體(DMSO)；EI-MS：m/z266 [M]+，分子式C15H22O4；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：0.71(3H，d，J=5.7 Hz，15-CH3)，0.99(3H，s，14-CH3)，1.89(3H，s，13-CH3)，4.48(1H，s，H-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：8.7(C-13)，16.6(C-15)，16.7(C-14)，20.1(C-2)，25.8(C-1)，29.1(C-4)，30.9(C-3)，33.9(C-10)，39.4(C-9)，43.1(C-5)，69.1(C-6)，105.3(C-8)，123.6(C-11)，157.4(C-7)，171.6(C-12)。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物12為6β,8β-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8α-olide。

化合物13無色晶體(DMSO)；EI-MS：m/z266 [M]+，分子式C15H22O4；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：0.67(3H，s，14-CH3)，0.92(3H，d，J=7.2 Hz，15-CH3)，1.74(3H，s，13-CH3)，4.48(1H，s，H-6)；13C NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：9.0(C-13)，15.9(C-15)，18.8(C-14)，20.3(C-2)，28.6(C-3)，28.8(C-1)，31.2(C-4)，35.9(C-10)，39.5(C-9)，45.6(C-5)，68.9(C-6)，104.9(C-8)，122.8(C-11)，162.7(C-7)，172.3(C-12)。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物13為6β,8α-dihydroxyeremophil-7(11)-en-12,8β-olide。

4 體外細胞毒活性篩選

采用MTT比色法測定單體化合物對胃癌HGC-27細胞和宮頸癌Caski細胞的細胞毒活性。

收集處于對數生長期的胃癌HGC-27細胞和宮頸癌Caski細胞，制成單細胞懸液，用培養液稀釋，使細胞濃度為(0.8～1)×105個/mL左右，每孔100 μL接種于96孔板，四周用PBS液封，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱中孵育待細胞貼壁后，約10小時后將不同濃度(終濃度，6.25、12.5、25、50、100 μM/L)的化合物加入孔中，每一濃度設置3個復孔，每孔終體積為200 μL，另設空白對照孔若干個，空白孔加100 μL的培養液。培養48 h后取出96孔板，在倒置顯微鏡下觀察，對染菌和藥物未溶解的細胞孔做好標記。之后在超凈工作臺中每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續培養4 h后，小心吸去96孔板內培養液，每孔加入150 μL的DMSO，低速震蕩5 min，使紫色結晶完全溶解。用酶標儀在波長490 nm下測定吸光值，計算出細胞抑制率:細胞生長抑制率=(正常細胞OD值-提取物處理組OD值)/提取物處理組OD值×100%，每次MTT實驗重復3次。

結果表明，所有化合物對胃癌細胞HGC-27和宮頸癌細胞Caski未顯示細胞毒作用(IC50>50 μM)。

5 結論

離舌橐吾在我國分布廣泛，民間用于治療流行性感冒、咳嗽、潰瘍和肺結核等癥。國內外學者從離舌橐吾中分離鑒定了倍半萜類，苯并呋喃類、三萜皂苷類、甾醇類、脂肪酸類等化合物，并發現其具有抗腫瘤、抗菌和抗炎等多種生物活性。倍半萜類化合物是其主要次級代謝產物。為進一步研究離舌橐吾的倍半萜類化合物，我們對離舌橐吾醇提物乙酸乙酯部位進行了深入研究，從中分離鑒定了13個艾里莫酚烷型倍半萜類化合物(包括3對非對映異構體)，其中11個為首次從該植物分離得到。采用MTT法評價了所得單體化合物的抗腫瘤活性，結果表明，所有化合物均未表現出顯著活性。該研究成果不僅豐富了離舌橐吾來源的倍半萜類化合物種類，而且為離舌橐吾中次級代謝產物的進一步研究奠定了基礎。