青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體的制備、表征及藥動學研究

李月靈，王麗華，周 競

1黃河科技學院，鄭州 450005；2上海市中藥研究所，上海 201401

青藤堿是從中藥青風藤SinomeniumacutumRehd.etWils中提取得到的一種生物堿單體。青藤堿具有抗腫瘤、鎮痛、降壓及抗心律失常等藥理活性[1]。近年來隨著對青藤堿的深入研究，發現其對肺癌、食道癌、胃癌、肝癌等腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用，因此非常有希望開發成為一種中藥抗腫瘤藥物。但青藤堿吸收較差，導致生物利用度較低。目前已有青藤堿微乳、固體脂質納米粒和脂質體等方面的研究[2-4]。

本課題組前期采用磷脂復合物技術成功制備了青藤堿磷脂復合物(sinomenine phospholipids complex)[5]，并對青藤堿磷脂復合物存在狀態和結合機制進行了研究。但青藤堿磷脂復合物分散性較差，體外溶出度收到很大限制[6-8]。納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers,NLC)系采用固態和液態混合脂質為載體制備的一種納米微粒給藥系統，不僅可極大提高藥物的分散性、促進藥物順利吸收、具有較高的載藥量及制劑穩定性等優勢，在藥物靶向方面也極具吸引力，有助于降低藥物毒副作用。為改善青藤堿磷脂復合物的分散性及給藥便捷性，本文進一步將青藤堿磷脂復合物制備成納米結構脂質載體，并對納米結構脂質載體進行體外和體內進行研究，期望為青藤堿的制劑的開發、研究提供有價值的借鑒。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

青藤堿(寶雞方晟生物開發有限公司，批號：201607005，純度：99.2%)；茶堿(中國科學院成都生物研究所，批號：20171015，純度：99.4%)；磷脂酰膽堿(批號：PC-98T，上海艾韋拓醫藥科技有限公司，含量>85%)；單硬脂酸甘油酯、油酸、泊洛沙姆188(國藥集團化學試劑有限公司)；肝素(南京新百藥業有限公司)；四氫呋喃為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

U3000型高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)；BP 210D型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)； ZRS-8型智能溶出試驗儀(天津大學無線電廠)；HWS-12型智能水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；旋轉蒸發儀(艾卡儀器設備有限公司)；JY92-II型探頭超聲儀(上海凈信實業發展有限公司)；Nano ZS90型納米粒度儀(英國 Malvern 公司)；Nanosep?超濾離心管(截留相對分子質量 10 000，美國 PALL 公司)； DZF-6050型真空干燥箱(上海躍進醫療器械廠)； MD200-2型氮氣吹掃儀(杭州奧威儀器有限公司)等。

1.3 動物

SD大鼠，雄性，7～8周齡，體質量300±20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 試驗方法與結果

2.1 青藤堿磷脂復合物的制備

稱取青藤堿0.33 g和卵磷脂0.82 g置于圓底燒瓶中，并加入200 mL四氫呋喃。45 ℃條件下磁力攪拌加熱4 h后，減壓旋蒸除去有機溶劑，將殘留物置于真空干燥箱內過夜。由于青藤堿不溶于無水乙醚，而其磷脂復合物在無水乙醚溶解良好，因此采用無水乙醚進行純化。具體過程為：加入無水乙醚溶解磷脂復合物粗品，0.45 μm微孔濾膜過濾除去游離的青藤堿。減壓旋蒸除去無水乙醚，真空干燥箱內過夜干燥后，將青藤堿磷脂復合物密封保存，備用。制備的磷脂復合物呈半固體狀態，青藤堿與卵磷脂的復合率接近100%[5]，質量分數為28.62%。

2.2 青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體的制備

取80 mg的青藤堿磷脂復合物，250 mg的單硬脂酸甘油酯及40 mg的油酸置于50 mL的圓底燒瓶中。加入6 mL無水乙醇后，置于溫度為65 ℃水浴中磁力攪拌溶解，作為油相。另稱取0.15 g的泊洛沙姆188置于20 mL的蒸餾水中，磁力攪拌加熱至相同溫度，作為水相。于攪拌速度為1 000 rpm條件下將油相緩慢滴加至水相中(用時約5 min)，2 h后即可形成納米結構脂質載體初乳。將初乳進行超聲15 min，迅速放入-20 ℃的冰箱進行固化3 h。采用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體。空白納米結構脂質載體采用相同質量的卵磷脂代替青藤堿磷脂復合物，同法制備即可。

2.3 方法學研究

2.3.1 色譜條件

Angilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水-乙二胺(v∶v∶v=40∶60∶0.3)；檢測波長為262 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣體積為20 μL。

2.3.2 標準曲線的制備及方法學驗證

精密稱取經干燥處理的青藤堿對照品10.00 mg，置于100 mL的容量瓶中。加入約70 mL的乙腈進行超聲8 min，于室溫放置30 min后，采用乙腈定容，即得濃度為100 μg/mL的青藤堿對照品儲備液。取適量儲備液進一步配制一系列濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的對照品溶液，HPLC測定各個濃度(C)的峰面積(A)。以C對A進行線性回歸，得出回歸方程為A=13.552 7C-0.0932 2(r=0.999 9)。根據相關系數r判斷，青藤堿在1.0～50.0 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

選取1.0 μg/mL(低)、25.0 μg/mL(中)和50.0 μg/mL(高)3種濃度，連續進樣6次考察精密度。結果顯示精密度分別為1.12%、0.66%和0.13%(n=6)；取空白納米結構脂質載體，分別加入低、中、高濃度的青藤堿對照品，加入乙腈進行超聲溶解，0.22 μm的微孔濾膜進行過濾，測定青藤堿含量，并計算回收率。結果顯示，平均加樣回收率為98.89%(n=6)，RSD均小于1.58%。按照“2.2”項下操作，制備6份青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體，HPLC測定青藤堿含量，考察方法的重復性。結果顯示，RSD小于1.80%(n=6)。任取一份樣品，分別于0、1、2、3、4、5 h進行HPLC分析，考察樣品的穩定性。結果顯示，RSD小于1.91%(n=6)。

2.4 納米結構脂質載體粒徑及Zeta電位的測定

取青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體混懸液，蒸餾水適當稀釋，并放入比色池中，測定其粒徑分布情況及Zeta電位。測定結果顯示，青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體平均粒徑為201.32±5.05 nm，聚合物分散系數(polymer dispersion index,Pdi)為0.180±0.048，見圖1；經測定其Zeta電位為-22.2±1.5 mV(見圖2)。

圖1 青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of sinomenine-phospholipids complex nanostructured lipid carries

圖2 青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體Zeta電位Fig.2 Zeta potential of sinomenine-phospholipids complex nanostructured lipid carries

2.5 包封率及載藥量的測定

精密量取1.0 mL青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體混懸液，加入到超速離心管內管中，并于轉速為12 500 rpm離心45 min。HPLC測定濾液中青藤堿的含量(m游離)。另精密量取1.0 mL的青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體混懸液，置于10 mL容量瓶中，乙腈超聲破乳后定容。HPLC法測定青藤堿的總含量(m總)，計算青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體包封率和載藥量。計算公式為：包封率(%)=[(m總-m游離)/m總]×100%；載藥量(%)=[(m總-m游離)/(m總脂質+m總-m游離)]×100%。式中m總表示青藤堿的總含量，m游離表示游離的青藤堿含量，m總脂質表示青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體中固態和液態脂質總量。

測定及計算結果顯示，青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體包封率為80.31%±1.01%；其載藥量為4.42%±0.28%。

2.6 體外釋放研究

取青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體混懸液3 mL，置于經處理后的透析袋中，兩端扎緊。取適量青藤堿原料藥加入蒸餾水制備混懸液，兩端扎緊。2種供試品分別加入到含50 mL蒸餾水的具塞錐形瓶中，置于溫度為37 ℃，速度為75 rpm恒溫振蕩器中進行青藤堿原料藥和青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體3種供試品體外釋放研究。分別于0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h不同時間點取樣2 mL，同時補進同體積的蒸餾水。HPLC測定釋放介質中青藤堿的含量，計算不同時間點的藥物累積釋放率，繪制時間-累積釋放度的釋放曲線。

青藤堿原料藥混懸液在4 h內累積釋放度為96.84%，基本釋放完畢。而青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體在8 h內累積釋放度為61.61%，屬于快速釋藥期，8 h后釋藥相對較慢，具有明顯的緩釋特征。分別采用零級釋藥模型、一級釋藥模型、Higuchi釋藥模型及Weibull釋藥模型對青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體體外釋藥過程進行模型擬合。結果發現，青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體體外釋藥模型符合Weibull釋藥模型，擬合方程為：LnLn(1/1-Mt/M∞)=0.576 6Lnt-1.478 1(r=0.988 8)。

2.7 體內藥動學研究

2.7.1 分組、給藥及血樣采集

取12只SD大鼠，雌雄兼用，隨機分為2組，每組6只。實驗前12 h禁食，自由飲水。采用0.5%的CMC-Na溶液配制青藤堿混懸液(以青藤堿計60 mg/kg)，取適量青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體的混懸液(以青藤堿計60 mg/Kg)，分別對SD大鼠進行灌胃給藥。于0、0.5、0.75、1.0、1.5、2、3、4、6、8、12、16 h眼眶靜脈采血，置于離心管中(肝素化)。立即于轉速為3 000 rpm條件下，離心3 min，轉移上層血漿置于-20 ℃冰箱冷凍保存，待測。

2.7.2 血漿樣品的處理

精密吸取大鼠血漿樣品100 μL置于離心管中，依次分別加入內標溶液50、200 μL甲醇和2.0 mL二氯甲烷，渦旋4 min后，在轉速為8 000 rpmn的條件下離心15 min。轉移上層有機相，于溫度為40 ℃條件下氮氣緩慢吹除有機溶劑。殘留物加入100 μL的流動相進行復溶，進HPLC測定青藤堿含量。

2.7.3 對照品溶液的配制及標準曲線

取經干燥處理的茶堿對照品10.0 mg置于50 mL容量瓶中，乙腈溶解后定容。進一步配制濃度為5.0 μg/mL的茶堿對照品溶液，備用。

取“2.3.2”項下青藤堿對照品儲備液，用乙腈稀釋配制成濃度為20.0 μg/mL。分別精密取200、100、50、20、10、5 μL置于含50 μL內標溶液的離心管中，揮去有機溶劑，加入200 μL大鼠空白血漿，分別得20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL的一系列青藤堿血漿樣品對照品溶液。按照“2.7.2”項下血漿處理方法進行處理，進HPLC測定青藤堿(As)與內標的峰面積(Ai)，計算兩者比值(As/Ai)。以As/Ai對青藤堿濃度(C)進行線性回歸。得出回歸方程為C=183.47As/Ai+6.17，r=0.998 8。因此，線性范圍為0.5～20.0 μg/mL，在此范圍內線性關系良好。

2.7.4 方法學考察

取SD大鼠空白血漿，對照品溶液和處理后的血漿溶液，按照“2.7.2”項下處理方法處理。結果顯示，血漿內源性物質不影響延胡索乙素的含量測定。

選取0.5 μg/mL(低)、10.0 μg/mL(中)和20.0 μg/mL(高)3種濃度分別進行日內精密度及日間精密度考察?？疾旖Y果顯示，低、中、高3種濃度血漿樣品的日內精密度RSD值均小于8.81%(n=3)；日間精密度RSD值均小于10.27%(n=3)。取青藤堿低、中和高濃度的血漿樣品，每種濃度測定3次，分別進HPLC測定峰面積，帶入“2.7.3”項下回歸方程，計算測定濃度。以測定濃度與配制濃度進行比較，得出回收率。考察結果顯示，3種質量濃度的血漿樣品回收率在88.10%～93.57%之間，RSD值為10.51%(n=9)。任取一含藥血漿樣品，經5天反復冷凍，每天1次，分別測定青藤堿與內標峰面積的比值，結果顯示其As/Ai變化無統計學意義(P>0.05)，血漿樣品在5天內基本穩定。因此，所建立的青藤堿血藥濃度測定方法可用于分析測定血漿中青藤堿的濃度。

2.8 藥動學結果

以青藤堿血藥濃度-時間點繪制青藤堿及其磷脂復合物納米結構脂質載體的血藥濃度-時間曲線(見圖4)。主要藥動學參數采用3P97程序統計矩模型進行計算，結果見表1。青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體的tmax與青藤堿原料藥相比無統計學意義，但Cmax由8.83±1.97 μg/mL極顯著性提高至15.73±3.86 μg/mL(P<0.01)，且T1/2顯著性延長，說明磷脂復合物納米結構脂質載體改變了青藤堿的藥動學行為，增強了體內吸收，延長了青藤堿在體內滯留時間。青藤堿制備成青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體后，其相對生物利用度提高到了1.75倍。

圖4 青藤堿及其磷脂復合物納米結構脂質載體藥-時曲線Fig.4 Drug concentration-time curves of sinomenine-phospholipids complex and its nanostructured lipid carriers

表1 青藤堿及其磷脂復合物納米結構脂質載體主要藥動學參數

注：與青藤堿原料藥相比，**P<0.01。

Note:Compared to sinomenine,**P<0.01.

3 討論

李熙等[4]制備的青藤堿微乳制劑中添加了大量的表面活性劑和助表面活性劑，進入人體后存在一定的溶血風險。張先洲等[2]對青藤堿固體脂質納米粒進行了研究，但平均包封率僅為65.7%，霍仲堅等[3]制備的脂質體包封率不足63%。包封率較低的原因可能是由于青藤堿脂溶性不佳，導致青藤堿和脂質載體之間的親和性較差。磷脂復合物技術可同時改善中藥活性成分的水溶性及脂溶性，促進順利吸收，提高其生物利用度已獲得中藥研究工作者的認可，是一種非常具有潛力的中藥新型給藥系統。但磷脂復合物一般呈半固體狀態，分散性很差，且穩定性也存在一定問題[9]。本研究將青藤堿磷脂復合物制備成納米結構脂質載體后，其分散性得到極大改善，也有助于提高磷脂復合物的穩定性，為進一步提高藥物的生物利用度及藥物抗腫瘤等療效奠定了基礎。由于磷脂復合物技術改善了青藤堿的脂溶性，青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體的包封率達到80.31%±1.01%，且處方中表面活性劑和助表面活性劑的用量大大降低，安全性相對較高。研究表明[10]，當兩種以上的乳化劑聯合使用時，可以發揮協調作用，有助于增加Zeta電位，提高穩定性。本文中用到的磷脂除了與青藤堿形成磷脂復合物外，還與非離子表面活性劑泊洛沙姆188發生協同作用，從而使制備的納米結構脂質載體粒徑分布均勻。

青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體在體外釋藥具有明顯的緩釋特征，經口服進入體內后tmax有所提前，說明納米結構脂質載體在體內具有獨特的吸收途徑。生物素受體主要分布于十二指腸和空腸，該腸段分布著豐富的毛細血管，是吸收的主要部位。納米結構脂質載體進入小腸后，在生物素介導的轉運途徑的作用下迅速吸收進入血液循環，最終導致tmax有所提前，增強了體內吸收，延長了青藤堿在體內滯留時間，相對生物利用度提高到1.75倍。分析原因[11-14]：納米結構脂質載體由于納米級別的粒徑可增加與胃腸道黏膜的接觸面積，有助于增加藥物吸收。納米結構脂質載體可在淋巴結構Peyer’s parches中聚集，通過M細胞吸收進入體循環，從而促進了藥物吸收。另外，納米結構脂質載體中的磷脂及泊洛沙姆188可增加胃腸道黏膜的通透性，也有助于增加藥物進入體循環的量[15]。本研究證明了青藤堿磷脂復合物制備成納米結構脂質載體的必要性、可行性及有效性。前期對青藤堿磷脂復合物促進透皮效果進行了研究[5]，對于青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體比如能否進一步提高青藤堿透皮效果有待于進一步研究。另外，由于納米結構脂質載體膠體溶液在水相環境中可能會發生一系列物理或化學變化，最終產生凝聚、沉淀及包封率下降等現象，因此青藤堿磷脂復合物納米結構脂質載體凍干粉針研究也是下一步研究工作的重點[16]。