益精杞菊地黃顆粒對(duì)慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜RGCs凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

張兆康 ，倘孟瑩 ，滕月 ，張麗霞

青光眼（glaucoma）是一種嚴(yán)重的致盲性眼病，視功能多呈進(jìn)行性、不可逆性損害。目前認(rèn)為青光眼的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 （retina ganglion cells，RGCs）的進(jìn)行性丟失。大量的臨床與基礎(chǔ)研究表明，細(xì)胞凋亡是青光眼視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失的主要途徑[1-4]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受多種基因調(diào)控，包括凋亡抑制基因和凋亡促進(jìn)基因，Bcl-2和Bax分別是這兩類基因中的典型代表。Caspase家族在細(xì)胞凋亡中也起著重要作用，Caspase-3屬于凋亡效應(yīng)亞類，直接促使細(xì)胞凋亡，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”。課題前期發(fā)現(xiàn)益精杞菊地黃顆粒劑對(duì)慢性高眼壓大鼠RGCs的凋亡有明顯的保護(hù)作用[5]，為了進(jìn)一步探討益精杞菊地黃顆粒抗RGCs的凋亡作用機(jī)制，應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及Real Time-PCR檢測(cè)技術(shù)觀察益精杞菊地黃顆粒對(duì)慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠7～8周齡60只,體重約 180～220 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。“益精杞菊地黃顆粒”由枸杞子配方顆粒、菊花配方顆粒、熟地黃配方顆粒、山萸肉配方顆粒、澤瀉配方顆粒、茯苓配方顆粒、黃芪配方顆粒等組成，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院藥劑科提供，加適量水溶解，無菌密封后放入4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將 “益精杞菊地黃顆粒”臨床成人劑量（mg/kg）的 5倍、10倍、20倍，分別定為低劑量組、中劑量組、高劑量中藥組，每組大鼠各12只，中藥高、中、低劑量組分別給予不同濃度的顆粒劑灌胃給藥。模型組與對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 高眼壓動(dòng)物模型的建立 根據(jù)燒灼鞏膜上靜脈法制成慢性高眼壓模型[6-7]，術(shù)前左氧氟沙星眼藥水沖洗眼部（右眼）消毒，于上瞼中點(diǎn)做牽引縫線以拉開眼瞼。在顯微鏡下，沿角膜緣外2 mm處行放射狀的切口剪開外側(cè)及上方球結(jié)膜，仔細(xì)分離筋膜和肌肉，可發(fā)現(xiàn)暴露鼻上、顳上和顳下象限2或3條鞏膜上靜脈，用眼科手術(shù)止血器燒灼這3支鞏膜上靜脈，烙閉成功的標(biāo)志即燒灼處?kù)o脈血流消失，近端靜脈充血怒張。術(shù)后用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，平復(fù)球結(jié)膜，復(fù)方妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。大鼠的平均眼壓在22 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上者則為造模成功。

1.2.3 取材及標(biāo)本制備 將大鼠過量麻醉處死，快速摘取右眼眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4℃環(huán)境下4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋備免疫組化用。過量麻醉大鼠后，無菌條件下摘除大鼠眼球，自角膜緣剪開去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜，放入無RNAse的離心管中，立即置-80℃冰箱中凍存，備Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)用。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫臘至水化，進(jìn)行抗原修復(fù)后脫水透明，中性樹膠封片固定；光鏡下分別觀察大鼠RGCs中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)情況,并利用Leica DM 2500顯微鏡Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件來進(jìn)行圖像采集和處理，每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野照相，所得的平均光密度值作為Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)水平。

1.3.2 Real Time-PCR檢測(cè) 用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以RNA模板進(jìn)行RT-PCR定量檢測(cè)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 60 s，（95℃ 15 s，60 ℃60 s）×40個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，△△ct=（實(shí)驗(yàn)組目的基因平均ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因平均ct值）-（對(duì)照組目的基因平均ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均ct值)。觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織中 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 的表達(dá)。

表1 Bcl-2、Bax、Caspase-3 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。 多組間的比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（One-way ANOVA）。兩組間的多重比較，采用LSD-t檢驗(yàn)，各組與對(duì)照組或模型組的比較，采用Dunnett t檢驗(yàn)(2-sided)。自身的前后對(duì)照比較用配對(duì)t檢驗(yàn),若P＜0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色法檢測(cè)各組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表達(dá)

干預(yù)1個(gè)月后，空白組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)較少，呈散在棕黃色顆粒狀。模型組大鼠RGCs中Bcl-2略有表達(dá)，Bax、Caspase-3明顯表達(dá)。中藥中劑量組大鼠RGCs中Bcl-2明顯表達(dá)，Bax、Caspase-3略有表達(dá)。中藥高、中劑量組大鼠RGCs中Bcl-2表達(dá)多，Bax、Caspase-3表達(dá)少（表 2，圖 1）。

各組大鼠RGCs中Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)平均IOD（平均積分光密度）值。與空白組相比，中藥治療組、模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)顯著增多（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而高、低劑量組 Bcl-2表達(dá)與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2，圖 1）

各組大鼠RGCs中Bax陽(yáng)性表達(dá)和平均IOD值和Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)平均IOD值。與空白組相比，中藥治療組、模型組Bax、Caspase-3表達(dá)均增多（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，中劑量中藥組促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達(dá)顯著減少（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高、低劑量組 Bax、Caspase-3表達(dá)與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 （表 2，圖 1）

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量

表2 各組大鼠RGCs中凋亡相關(guān)因子IOD值比較（xˉ±s，n=12）

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組大鼠RGCs中Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)（免疫組化染色×40）

Bcl-2 mRNA：與空白組相比，中藥治療組、模型組均有顯著性差異（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，中藥中劑量組、低劑量組的Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增多（P＜0.01），有顯著保護(hù)作用；高劑量組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 （表 3，圖 1）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（，n=6）

注：*與模型組比較，表示P＜0.05；#與空白組比較，P＜0.05

組別 mRNA表達(dá)量Bcl-2 Bax Caspase-3空白組 0.593±0.083* 0.499±0.005* 0.641±0.047*模型組 1.126±0.203# 1.333±0.257# 1.503±0.029#高劑量中藥組 1.333±0.086# 1.296±0.155# 1.429±0.047#中劑量中藥組 2.026±0.161*# 0.960±0.072*# 1.123±0.015*#低劑量中藥組 1.750±0.111*# 1.036±0.077*# 1.426±0.071#F 49.37 16.54 178.76 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

Bax mRNA：中藥治療組、模型組與空白組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著減少 （P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量中藥組的Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量減少（P＜0.05）;而高劑量組與模型組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

Caspase-3 mRNA：中藥治療組、模型組與空白組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，中劑量中藥組的Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而高、低劑量組與模型組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

3.1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用

細(xì)胞凋亡發(fā)生、發(fā)展受多種基因調(diào)控，目前認(rèn)為與RGCs凋亡相關(guān)的基因中，以Bcl-2、Bax和Caspase-3最為典型[8]。Bcl-2家族包括抑制細(xì)胞凋亡的（Bcl-2，Bcl-xl等）和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的（Bax、Bad 等）兩類蛋白亞群。Bcl-2基因，即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因，是比較重要的抗凋亡基因，而Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是典型的凋亡促進(jìn)基因。Caspase家族在細(xì)胞凋亡中也起著重要作用，Caspase-3屬于凋亡效應(yīng)亞類，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是凋亡途徑的共同下游部分，直接促使細(xì)胞凋亡，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白”。Bcl-2、Bax作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制，其表達(dá)能抑制各種因素所誘發(fā)的Caspase-3的激活和凋亡。在燒灼上鞏膜靜脈法誘導(dǎo)的慢性青光眼大鼠模型中發(fā)現(xiàn)[9]，模型眼較正常眼視網(wǎng)膜中Bcl-2蛋白的表達(dá)增多，治療組較高眼壓組Bcl-2表達(dá)顯著增加，說明Bcl-2可能參與了青光眼RGCs凋亡及視神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制。

通過本實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白在空白對(duì)照組RGCs中有少量表達(dá)；高眼壓模型組和中藥治療組RGCs中bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)均較對(duì)照組增多；Bcl-2表達(dá)中藥中劑量組較模型組顯著性增加，Bax和Caspase-3蛋白的表達(dá)中藥中劑量組較模型組顯著性減少。因此我們選擇bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。Bcl-2在RGCs中的作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)胞色素C釋放、下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平、抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化等保護(hù)視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。而Bax可促使視神經(jīng)軸突損傷，維持電壓依賴性陰離子通道的開放使線粒體外膜完整性丟失。Caspase-3主要在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用下，其效應(yīng)被激活，水解細(xì)胞內(nèi)靶物質(zhì)，降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，則引起細(xì)胞凋亡。

3.2 探討益精杞菊地黃顆粒對(duì)慢性高眼壓大鼠RGCs的作用機(jī)制

益精杞菊地黃顆粒劑由杞菊地黃丸化裁而成。杞菊地黃丸源于《醫(yī)級(jí)》，在經(jīng)典方劑六味地黃丸的基礎(chǔ)上加枸杞子、菊花而成，具有滋陰、養(yǎng)肝、明目之效。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)益精杞菊地黃顆粒在一定程度上可減少RGCs凋亡，對(duì)青光眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少。同樣RT-PCR法檢測(cè)顯示，中劑量組中藥較模型組Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著增多，Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著減少，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中各用藥組眼壓輕度下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，益精杞菊地黃顆粒可能通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3的表達(dá)，來發(fā)揮其保護(hù)RGCs的作用，并不是通過降低眼壓來實(shí)現(xiàn)的。至于其確切機(jī)制是否與其他凋亡因子有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。由上所述，益精杞菊地黃顆粒通過調(diào)控基因蛋白，對(duì)抗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，從而保證視功能正常發(fā)揮。