脾氣虛型兔視網膜脫離自動復位后視網膜電圖的研究

張妍春 ，孫娟玲 ，任秀瑜 ，雷春靈 ，任美俠 ，曹爽 ，楊欣 ，李亞芙

孔源性視網膜脫離 （rhegmatogenous retinal detachment,RRD）是伴有嚴重的急性視力喪失的眼科疾病，即使脫離的視網膜成功復位，由于視網膜感光層變性及其引發的視網膜細胞和色素上皮細胞解剖結構重建的發生，患者往往會有永久性視功能損失[1-2]，視網膜電流圖（Electroretinogram，ERG）檢查表現為反應降低[3]。前期采用耗氣破氣加饑飽失常法建立脾氣虛證以及在顯微鏡下行視網膜下注射透明質酸鈉術建立RRD自動復位的證病結合動物模型進行系列研究[4-6]，證實脾氣虛證對RD復位后視網膜三級神經元細胞結構的重塑均有不良影響，復位區域視網膜雙極細胞層及節細胞層的病理改變更為嚴重且恢復緩慢，這將不利于復位后視網膜視功能的恢復。本文通過對實驗性脾氣虛證RRD復位后ERG的研究，進一步探討脾氣虛證對復位后視網膜功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年清潔級新西蘭灰兔 （2.0~2.5 Kg）21只，雌雄不拘，經裂隙燈、眼底鏡檢查眼前節及眼底均無異常，實驗動物及實驗室均由第四軍醫大學動物實驗中心提供。將21只實驗兔隨機分為3組，A組為空白對照組，B組為RRD自動復位組、C組為脾氣虛型RRD自動復位組，A組兔3只，B組兔9只，C組9只，分別在實驗開始時及建立RD自動復位模型手術后第 10 d、20 d、30 d，B、C組隨機抽取 3只（6只眼）進行檢查。

1.2 脾氣虛證及RRD自動復位動物模型的制備

采用耗氣破氣加饑飽失常脾氣虛證動物模型制備方式[7]，按照先前的方法制備脾氣虛證兔模型[5]。C組兔于實驗開始后隔日經胃管灌喂厚樸三物湯煎劑（厚樸、枳實、大黃按 3∶3∶2 比例混合制成，每 2 d 用藥量12 g/Kg體重），喂藥當日禁食，次日喂飼不限量。A、B組同時隔日經胃管灌喂生理鹽水等量，實驗期間給予正常飲食及飲水量。共持續42 d造脾氣虛證動物模型。

RRD自動復位模型于脾氣虛證動物模型造模開始后第22 d制備。按照先前的方法，B組及C組兔經玻璃體視網膜下注射0.2%的透明質酸鈉造RRD自動復位動物模型[5,8]。

1.3 觀察指標及測試方法

1.3.1 宏觀指標及血清D-木糖檢測方法 在造模和恢復過程中觀測宏觀癥狀體征指標包括兔子的精神，癥狀，大便及小便情況，活動度,舌象，肛溫，食量等， 分別在 0 d、22 d、32 d、42 d、52 d 清晨喂食飼料前稱量實驗兔體重，喂食顆粒飼料（30 g/kg），2 h后抽取靜脈血檢測血清D-木糖。具體檢測方法同先前的研究[5]。

1.3.2 眼底檢查 于RRD模型造模后每天使用直接檢眼鏡觀察并記錄眼底視網膜脫離的范圍、視網膜隆起的高度、裂孔大小、視網膜出血情況和玻璃體反應等情況至視網膜自動復位。復位后每周直接檢眼鏡檢查玻璃體及視網膜1次。

1.3.3 F-ERG的檢測方法 使用GT-2000NV多焦視覺電生理系統(國特醫療)，于術前，術后10 d、20 d、30 d在B、C組中各隨機抽取3只 （6只眼）及A組3只（6只眼）進行F-ERG檢測。具體方法：將新西蘭灰兔用復方托品酰胺眼液散瞳3次后暗適應30 min，放入特制的固定兔架中，結膜囊內滴入0.5%地卡因表面麻醉，再滴入1%的甲基纖維素，置入角膜接觸電極，參考電極和地電極采用自制的針電極植入額部正中皮下和耳緣皮下。將頭部置于刺激球中央，遮蓋一眼，單眼分別記錄暗視反應（記錄單次反應），暗視眼最大反應（記錄單次反應），∑Ops，即振蕩電位總和（疊加平均4次），單閃光視錐細胞反應（疊加平均10次）。

1.4 統計方法

選用SPSS13.0統計軟件進行分析，經正態性檢驗后，符合正態分布者左右眼間比較采用t檢驗，組間比較采用多因素方差分析，不符合正態分布者采用秩和檢驗，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宏觀指標

入組前3組兔全身宏觀指標均未見明顯異常，實驗過程中A組及B組兔全身未見出現特殊情況，C組兔制備脾氣虛證模型開始后1周全面出現納食量減少、精神萎靡、蜷縮嗜臥、受驚時無神、軟便、體重減輕等脾氣虛證一般癥狀及體征，停止脾氣虛造模因素后觀察到該組兔軟便、毛色灰白、體重減輕、精神倦怠等脾氣虛證一般癥及狀體征持續至實驗結束，A、B兩組兔各時間點體重未見明顯統計學差異，C組在各檢查時間點體重較A、B組顯著降低 （P＜0.05,圖1A）。RRD制備術前C組兔D-木糖值明顯降低，停止造氣虛模型后有所恢復，但與A、B組相比，仍維持在較低水平（P＜0.05）（圖 1B）。

2.2 眼底檢查

術后第1 d觀察所有實驗眼屈光間質透明，B、C組下方視網膜灰白色隆起，鼻下方近赤道部視網膜裂孔，RRD維持5～9 d后視網膜自動復位，B組平均6.2 d，C 組平均 8.3 d。

2.3 閃光視網膜電圖（F-ERG）檢查

實驗開始時隨機抽取的9只兔18只眼ERG各波振幅、潛伏期（xˉ±s）如表 1 所示，經統計學分析，除單次閃光視錐細胞a波b波振幅、單次閃光視錐細胞b波峰時及30 Hz閃爍光反應振幅等檢測值外，其它檢測值符合正態分布，對符合正態分布的檢測值進行t檢驗及方差檢驗，不符合正態分布的進行秩和檢驗，結果顯示左右眼及3組間均無統計學差異（P＞0.05）。

圖1 3組動物體重及血清D-木糖值變化。1A體重；1B血清D-木糖值。 C 組與 B 組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

空白對照組、RRD自動復位組、脾氣虛型RRD自動復位組不同時期ERG數據經統計學正態性檢驗，采用多因素方差分析對符合正態分布的ERG檢測值進行比較，發現暗視ERG a波潛伏期、暗視ERG b波潛伏期，暗視ERG b波振幅，暗視∑OPs振幅等檢測值在各實驗組間差異有統計學意義，對以上數據進一步兩兩比較，結果如圖2所示。暗視ERG a波潛伏期術后10 d，B、C組較A組均延長，比較有統計學意義。隨復位時間延長B、C組暗視ERG a波潛伏期逐漸縮短，術后20 d、30 d與A組無統計學意義；暗視ERG b波潛伏期B、C組術后10 d,20 d較A組顯著延長，隨復位時間延長，B組潛伏時間縮短，術后30 d與A組無統計學差異，C組術后30 d暗視ERG b波潛伏期較A組、B組均顯著延長；暗視ERG b波振幅術后各檢查時間點B組與A組比較，無統計學差異，C組術后20 d、30 d較A組均明顯下降，其中術后20 d較B組亦顯著下降；∑OPs振幅B、C組術后10 d、20 d均與A組比較無明顯統計學差異，C組至術后30 d較A組顯著降低。采用秩和檢驗對不符合正態分布的ERG檢測值進行比較，未發現組間有明顯統計學差異。

表1 兔眼ERG初始數據（例數=18）

圖 2 術后 F-ERG 各項目變化。2A 暗視 a波潛伏期（ms）；2B 暗視 b 波潛伏期（ms）；2C 暗視 b 波振幅(μV)，2D ∑OPs振幅(μV)。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3 討論

視網膜電圖是視網膜受刺激時記錄到的視網膜電反應總和，是一種無創傷性視功能檢測方法，具有客觀性，分層定位作用，能反映從光感受器到無長突細胞的視網膜各層細胞電活動，采用不同的刺激條件還可以分離視錐細胞和視桿細胞，是了解視功能最敏感的方法之一。常見波形為一個負相的a波和一個正相的b波，一般認為a波起源于光感受器內段(視細胞層),b波起源于Müller細胞或雙極細胞(主要位于內核層)，OPs波（震蕩電位）是附加在b波上的一系列節律性低振幅電位，代表視網膜內核層神經元抑制性反饋性突觸環路的活動，可能起源于雙極細胞或內叢狀層細胞，與視網膜循環變化密切相關，它也是明視系統和暗視系統的混合反應。像中樞神經系統一樣，視網膜有強大的細胞結構重塑能力，包括視桿細胞軸突回縮，水平細胞伸展，Müller細胞增殖及結構重組[9-10]。研究發現RRD患者視網膜成功復位后感光細胞外節基本能完全再生，并且與色素上皮層形成良好的連接，ERG功能隨之恢復，但是如果外核層、外叢狀層或內核層不能完全修復，ERG會有永久損傷[11]，因此，視網膜脫離與復位后視網膜結構的重建與視功能恢復有緊密的聯系。

本實驗通過對各實驗組RD復位后不同時期進行ERG檢查發現RRD自動復位組、脾氣虛型RRD自動復位組視桿細胞感光層功能在術后視網膜復位早期受到影響，隨時間延長逐漸恢復。RRD自動復位組術后復位早期視桿細胞、視錐細胞內層視網膜功能均受到明顯影響，隨復位時間的延長RRD組內層視網膜功能逐漸恢復，與以往文獻報道相一致[12]。脾氣虛型RRD自動復位組視桿細胞、視錐細胞內層視網膜功能明顯較RRD自動復位組恢復緩慢，至術后30 d仍處于較低水平，與空白對照組差異顯著。以上實驗結果首次證實脾氣虛證這一病理狀態對RRD復位后Müller細胞和雙極細胞、無長突細胞等視網膜內層細胞的功能恢復造成不利影響，而且涉及視錐細胞和視桿細胞，這與我們前期觀察到的脾氣虛證加重RRD復位后視網膜細胞的凋亡[13]，并對RD復位后視網膜雙極細胞層及節細胞層的形態學影響更為嚴重且恢復緩慢的結論一致[4-6]，但是發生以上情況的具體原因有待進一步研究。提示臨床應該注意患者全身證候可能對視網膜脫離復位后視功能恢復帶來的影響。