3D打印PLLA/β-TCP復合人工骨及組織相容性研究

岑超德，張永，羅聰，鄔均，劉福堯，吳聲忠

(1.貴州省骨科醫院骨科，貴州 貴陽 550000；2.貴陽市第一人民醫院，貴州 貴陽 550000；3.重慶醫科大學附屬兒童醫院骨科，重慶 400014)

由高能量創傷、感染、腫瘤等因素導致的骨缺損，尤其是大段骨缺損，已成為骨科臨床上的一大難題，目前發生率較高[1]。傳統的治療方法主要有自體及異體骨移植、骨搬移術、Masquelet技術、人工植骨材料修復等[2-4]。然而，自體骨移植存在供體受限的問題，異體骨存在免疫排斥的弊端[5，6]，骨搬移術存在痛苦大、治療周期長的缺點[7]，Masquelet技術被用于各種骨缺損的治療并取得令人鼓舞的成果，但其存在骨量來源有限的困擾[8]。目前常用的人工植骨材料多為降解緩慢甚至不降解的材料，人工骨內部常出現成骨死角及骨缺損修復不全的情況。可見，尋求理想的人工骨成為治療骨缺損的關鍵。

隨著材料學的不斷發展，應用各種技術制備的納米仿生人工骨為解決這一問題開辟了一條嶄新的途徑，理想的人工骨應該盡量仿生天然骨的組成及結構。聚乳酸類材料屬于有機高分子材料，因其具備良好的組織相容性、可降解等特性而被美國FDA批準應用于臨床，其中左旋聚乳酸具有良好的力學性能，其降解產物呈酸性[9]。β-磷酸三鈣具備骨引導性，脆性大，降解產物呈堿性。3D打印又名增材制造，是在計算機控制下，按照預設數據，采用合適的原料層層堆積制作實物的技術。本文結合兩者材料的優缺點，基于3D打印技術仿生構建左旋聚乳酸(poly L-lactic acid，PLLA)/β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)可生物降解復合人工骨，對其性能及組織相容性進行研究，探究其作為體內組織工程骨材料的可行性。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 左旋聚乳酸(PLLA，Mw=50 000，濟南姝遠生物科技有限公司)，β-磷酸三鈣(β-TCP，d50=0.2～5.0 μm，純度99%，南京埃普瑞納米材料有限公司)。C3H10細胞(重慶醫科大學附屬兒童醫院干細胞庫)，DMEM培養基、胎牛血清(Gibco公司)，PBS緩沖液(碧云天生物技術研究所)，綠色熒光蛋白腺病毒(Ad-green fluorescent protein，Ad-GFP)、骨形態發生蛋白-9腺病毒(Ad-bone morphogenetic protein-9，Ad-BMP9)(芝加哥大學醫學中心何通川教授惠贈)，茜素紅S、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)定量檢測試劑盒、萘酚AS-MX堿性磷酸鹽溶液和快速藍重氮鹽(美國Sigma公司)。C3H10細胞(小鼠骨髓來源的間充質干細胞，由重慶醫科大學附屬兒童醫院兒科研究所干細胞實驗室提供)。

1.2 實驗儀器 3D打印機(型號Bio-Architect?-Lite，杭州捷諾飛生物科技股份有限公司)，水銀孔率計(AutoPore IV 9500，英國Micromeritics)，動靜態疲勞試驗機(型號3330，美國BOSE公司)，掃描電鏡(型號S-3000N，日本日立公司)。

1.3 PLLA/β-TCP復合人工骨的制備 先利用三維計算機輔助設計(Computer aided design，CAD)軟件設計支架材料。材料屬性設置為直徑8 mm、壁厚3 mm、長2.0 cm的中空圓柱狀結構，孔徑為400 μm，孔隙率60%。將設計完成的材料轉換成STL格式并輸入3D打印機。具體過程：將適量的PLLA(Mw=50 000)和β-TCP溶于1、4-二氧六環中，PLLA與1、4-二氧六環的質量體積比為15%，PLLA與β-TCP的質量比分別為(4︰1，2︰1及3︰2，分別簡稱為P/T20，P/T30及P/40)，磁力攪拌器勻速攪拌形成均一膏狀原料備用。調整3D打印機相關屬性參數進行材料打印(噴頭直徑400 μm，速度2 mm/s)。本實驗選用的3D打印技術是在熔融沉積造型術(fused deposition modeling，FDM)基礎上選用生物擠壓方法進行打印PLLA/β-TCP復合人工骨，紫外線消毒后備用。

1.4 PLLA/β-TCP復合人工骨的物理性能檢測

1.4.1 PLLA/β-TCP復合人工骨的微觀結構 復合人工骨試樣經噴金后，于掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)下觀察其微觀結構。

1.4.2 PLLA/β-TCP復合人工骨的孔隙率 復合人工骨的孔隙率根據以下公式進行測定[10]：孔隙率=(1-ρa/ρt)×100%(其中ρa為復合人工骨的實際密度，將人工骨浸入水銀液體中根據阿基米德原理計算出，而ρt為復合人工骨的理論密度，PLLA和β-TCP的理論密度分別為1.3 g/cm3和3.07 g/cm3)。

此外，為了比較不同方法對孔隙率測量造成的誤差，用水銀孔率計在壓力414 Pa至3.7 kPa的范圍內對PLLA/β-TCP復合人工骨進行孔隙率的測定。

1.4.3 PLLA/β-TCP復合人工骨的力學性能 人工骨的力學強度由動靜態疲勞試驗機進行測定。彈性模量檢測樣品直徑為8 mm，壁厚3 mm，長9 mm。彈性模量=應力/應變(EapP=Kh/A，K=F/d，其中F為應力，d為壓縮長度，A為材料橫切面積，h為材料長度)。將壓縮過程的應力作為縱軸、應變作為橫軸，通過Matlab軟件(The MathWorks)編程生成應力應變關系曲線，較為固定的一段直線區域的斜率即為人工骨彈性模量[11]。三點抗彎強度為在人工骨的兩支點之間施加載荷，至試件破壞時的單位面積載荷值，由公式δfmax=8FmaxL/πd3計算出人工骨的抗彎強度(其中Fmax為最大載荷，L為兩支點跨度，d為人工骨直徑)[12]。其中試驗機加載速度為0.1 mm/s(每組測試5個樣品)。

1.5 PLLA/β-TCP復合人工骨的細胞培養 PLLA/β-TCP復合人工骨無菌PBS清洗3遍后，于20%血清培養基中提前浸泡2 h取出后放入清潔干燥的培養皿中，將制備好的C3H10細胞懸液(6×106/mL)滴入人工骨，于37 ℃、5%CO2溫箱中培養3 h后加入含血清培養基。繼續培養3 d后將支架取出，用0.9%生理鹽水沖洗支架，4%戊二醛固定過夜，叔丁醇干燥、噴金行掃描電鏡(SEM)檢測。

1.6 PLLA/β-TCP復合人工骨浸提液的誘導分化作用 將2 g人工骨加入15 mL的血清培養基，37 ℃、5%CO2條件下孵育7d后離心取上清液，經0.22 μm過濾器過濾得到浸提液。按2×103/孔密度將C3H10細胞接種于12孔板中，每組3個復孔，待貼壁后吸去培養基，實驗設計分組如下：a)GFP陰性對照組：加入1.5 mL含腺病毒Ad-GFP(20 μg/mL)培養基；b)PLLA組：加入純PLLA人工骨浸提液1.5 mL；c)P/T30組：加入P/T30人工骨浸提液1.5 mL；d)BMP9(Bone Morphogenetic Protein-9)陽性對照組：加入1.5 mL含腺病毒Ad-BMP9(20 ng/mL)培養基。C3H10細胞誘導分化至第7天，加入萘酚AS-MX堿性磷酸鹽溶液和快速藍重氮鹽混合染液250 μL，37 ℃避光孵育30 min，在光鏡下觀察并成像，陽性染色呈藍紫色。C3H10細胞誘導分化至第21天，每孔加入300μL的4%多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次。每孔加入300 μL現配的0.4%茜素紅S染液，37 ℃孵育30 min，在光鏡下觀察并成像，陽性染色為桔紅色沉淀。

1.7 PLLA/β-TCP復合人工骨的組織相容性 選取健康新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。待戊巴比妥鈉(30 g/L)耳緣靜脈麻醉生效后制作股四頭肌肌袋及臀肌肌袋，肌袋內植入純PLLA人工骨及P/T30組復合人工骨。植入后1個月行X線透視觀察復合人工骨位置及局部炎癥反應情況。分別于術后第1個月、第2個月及第3個月將人工骨連同周圍0.5 cm范圍的組織取出，用10%甲醛固定組織1周，標本常規系列脫水及石蠟包埋固定，常規切片后行VG染色(Van Gieson染色)，在光學顯微鏡下觀察組織對材料的反應情況。按照ISO10993-2007和GB/T16886.1-1997中的組織反應分級方法進行評估。

2 結 果

2.1 PLLA/β-TCP復合人工骨的大體觀 臨界骨缺損即骨缺損自身不能愈合，一般認為是長骨長度的15%或者骨干直徑的1.5～2.5倍[13]。根據6月齡新西蘭大白兔橈骨的尺寸參數，得到以下制作人工骨的數據。如圖1所示，3D打印的PLLA/β-TCP復合人工骨為直徑8 mm，長2 cm的中孔圓柱狀結構，壁厚3 mm，人工骨呈白色，表面粗糙，質均勻，人工骨成品的尺寸與3D打印設計的幾何模型尺寸基本一致。

a 3D打印模型尺寸 b 樣品大體觀

圖1 PLLA/β-TCP復合人工骨

2.2 PLLA/β-TCP復合人工骨的物理性能

2.2.1 PLLA/β-TCP復合人工骨的微觀結構 如圖2所示，掃描電鏡下可見純PLLA人工骨和含β-TCP人工骨表面粗糙，人工骨內部布滿豐富的微孔，微孔直徑分布在20～400 μm之間，孔隙之間存在一定的交通率。隨著β-TCP含量的增加，人工骨粗糙程度增加。豐富的微孔可增加人工骨的表面積，可為細胞提供足夠的生長空間。人工骨一定的孔隙交通率有利于細胞之間的相互作用、營養物質的交換、血管及神經的長入以及鈣鹽的充分沉積。

2.2.2 PLLA/β-TCP復合人工骨的孔隙率 人工骨的孔隙交通率和研究者的主觀性可能會影響孔隙率的測定，因此孔隙率用兩種不同的方法測定。如圖3所示，用密度法和孔率計法所測得的人工骨孔隙率與3D打印設計的孔隙率存在一定的差距，這能為后期批量打印植入體內的人工骨提供指導性的信息。隨著β-TCP含量的增高，人工骨的孔隙率呈下降趨勢，用兩種方法測得的孔隙率結果趨勢一致(P>0.05)。這主要是受生物擠壓的影響，擠壓減小了人工骨整體孔隙的容積。此外，β-TCP固體顆粒的增多不同程度地提高了人工骨孔壁的厚度，人工骨的孔隙交通率下降不利于水銀的滲透，這些因素均對孔隙率的測定存在一定的影響。

2.2.3 PLLA/β-TCP復合人工骨的力學性能 彈性模量是物體彈性變形難易程度的表征，而抗彎強度是外力施壓時的強度極限，我們通過測定復合人工骨的彈性模量及抗彎強度來評價其機械性能。圖4a所示為人工骨的應力/應變曲線，骨支架的彈性模量在應力/應變曲線上表現為一段直線區域的斜率。圖4b所示，β-TCP的加入增加人工骨的韌性，減小其形變，使得彈性模量及抗彎強度相應增加，抗彎強度變化趨勢與彈性模量基本一致。3D打印過程中當β-TCP含量為30%時PLLA與β-TCP能達到有效穩固的結合，此時彈性模量可高達21.1 MPa，三點抗壓強度可高達9.9MPa。β-TCP的含量超過30%時復合人工骨脆性增加，復合人工骨的彈性模量及抗壓強度驟降而不利于體內的應用。

2.3 PLLA/β-TCP復合人工骨的細胞培養 人工骨細胞培養是評價其細胞相容性的重要指標，也是人工骨用于體內的前提之一。如圖5所示，純PLLA人工骨細胞培養幾乎未發現C3H10細胞的爬行生長，這可能與材料的疏水性質不利于細胞在材料界面吸收營養物質而增殖有關。人工骨掃描電鏡觀察發現P/T 20、P/T 30與P/T 40組復合支架均可見不同程度的細胞爬行生長，β-TCP的摻入改善了人工骨的親水性質和骨引導性，且β-TCP顆粒可增加復合人工骨界面的粗糙度，這些因素是影響細胞能否黏附生長的關鍵。

a PLLA組 b P/T20組 c P/T30組 d P/T40組

圖2 不同組分的PLLA/β-TCP復合人工骨的微觀結構(×100)

圖3 不同組分PLLA/β-TCP a 應力-應變曲線 b 復合人工骨的力學強度復合人工骨的孔隙率測定 圖4 不同組分的PLLA/β-TCP復合人工骨的力學性能

a PLLA組 b P/T20組 c P/T30組 d P/T40組

注：圖中箭頭所示為C3H10細胞

圖5 不同組分的PLLA/β-TCP復合人工骨的細胞培養(×400)

2.4 PLLA/β-TCP復合人工骨的細胞誘導分化 由于P/T 30復合人工骨具備優良的物理性能，我們選擇其作為后續的研究材料。目前公認的能誘導細胞成骨分化的因子是骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，包括BMP2、BMP9等。β-TCP的摻入能否改善人工骨的細胞骨誘導性，我們將表達BMP9的腺病毒Ad-BMP9感染的細胞作為陽性對照，而將表達綠色熒光蛋白的腺病毒Ad-GFP感染的細胞作為陰性對照(如圖6a及圖6b)。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是細胞成骨分化的早期檢測指標，堿性磷酸酶在堿性環境下將體系中的α-磷酸萘酚鈉水解為α-萘酚，它與重氮鹽偶聯后形成難溶性藍紫色沉淀，沉積于表達酶的細胞處。如圖6c所示，各組C3H10細胞經誘導分化至第7天行ALP染色，Ad-GFP組及PLLA組幾乎未見藍染細胞，P/T30組及Ad-BMP9組可見部分紫藍染細胞，其中Ad-BMP9組較P/T30組有較多的藍染細胞(P<0.05)。這說明單純的PLLA人工骨不能誘導C3H10細胞表達堿性磷酸酶，而β-TCP能誘導C3H10細胞表達堿性磷酸酶，此結果一定程度地說明β-磷酸三鈣具有一定的成骨誘導活性。

鈣鹽沉積是細胞成骨分化較晚期的檢測指標，茜素紅是陰離子染料，可與晚期沉積的鈣離子以螯合方式形成桔紅色復合物。如圖6d所示，各組永生化C3H10細胞經誘導分化至第21天行茜素紅染色，Ad-GFP組及PLLA組幾乎未見桔紅色沉淀，P/T30組及Ad-BMP9組可見部分桔紅色沉淀，其中Ad-BMP9組較P/T30組明顯(P<0.05)，此結果與堿性磷酸酶染色結果一致，更進一步提示β-磷酸三鈣具有一定程度的骨誘導活性。

a 熒光顯微鏡圖

b 光學顯微鏡圖

c ALP染色

d 茜素紅S染色

2.5 PLLA/β-TCP復合人工骨植入肌袋試驗 人工骨的最終研究目的是應用于體內，雖然PLLA的最終降解產物為CO2和H2O，而磷酸三鈣降解后釋放的鈣、磷離子能成為機體鈣磷庫的成分，單一的成分均已被證實安全而廣泛應用于臨床，其安全性可靠。但PLLA/β-TCP復合人工骨植入體內后是否存在炎癥反應是我們重點關注的問題，因此我們進行了體內植入實驗。X線透視可見人工骨與兔子股骨顯影效果相當，這可為支架植入體內后降解及新骨沉積的體外攝片評估提供便利(見圖7a)。如圖7b所示，植入后3個月，純PLLA人工骨周圍可見充血水腫的組織包裹，組織與人工骨關系疏遠，較易分離。而P/T30復合人工骨周圍組織未見明顯充血水腫，組織與人工骨關系密切，不易分離(見圖7c)。

a X線透視體內復合人工骨(箭頭所示)

b PLLA人工骨連同周圍0.5 cm組織大體觀

c P/T30復合人工骨連同周圍0.5 cm組織大體觀

2.6 PLLA/β-TCP復合人工骨的組織相容性 為了進一步研究人工骨的組織相容性，我們對植入的純PLLA人工骨以及P/T30復合人工骨連同周圍1 cm的組織進行了組織學評價。如圖8所示，人工骨植入后1個月：PLLA組人工骨初步形成疏松水腫的纖維包囊，包囊組織內可見有大量的中性粒細胞和纖維母細胞浸潤。而P/T 30組人工骨周圍纖維包囊較疏松，纖維包囊有部分中性粒細胞浸潤。人工骨植入后2個月：PLLA組人工骨表面纖維包囊致密且較厚，纖維包囊有部分中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，周圍組織見少量點狀充血。而P/T30組人工骨周圍纖維包囊致密，纖維包囊有少量的淋巴細胞浸潤。人工骨植入后3個月：PLLA組人工骨表面纖維包囊囊壁有變薄趨勢，包囊內仍可見淋巴細胞浸潤，偶見部分炎癥細胞。而P/T30組人工骨表面局部纖維包囊變薄，由1-2膠原纖維和少量纖維細胞組成，包囊內僅見少許淋巴細胞浸潤。人工骨與周圍組織結合密切，界限模糊(圖中單向箭頭所示為炎癥細胞，雙向箭頭所示為纖維包囊厚度)。依照國際及國家醫療器械的植入后局部反應試驗標準(2003年)，PLLA/β-TCP復合人工骨在體內無反應或僅有輕度的組織反應，是一種組織相容性良好的支架材料。

注：圖中單向箭頭示炎癥細胞，雙向箭頭示纖維包囊厚度

3 討 論

自1995年Crane等提出骨組織工程的概念以來，組織工程骨的發展為人類骨組織缺損的修復重建帶來了全新的希望。而3D打印技術的興起，為組織工程骨的構建提供了優越的條件。利用電腦進行輔助設計3D生物打印制作的仿生組織工程骨結構更加近似天然骨結構，并可進行個性化定制[14]。

聚乳酸類材料及β-TCP因具備良好的生物學性能常被研究者利用不同的3D打印技術來制作組織工程骨。李樹祎等[15]利用低溫快速成型技術制備了PLGA/TCP的骨修復支架，其孔隙豐富，生物相容性良好。許國軍等[16]采用3D打印直寫成型技術制備了不同成分的β-TCP/HA/PLA復合支架，支架表面粗糙而具有通孔，細胞骨誘導性明顯。本實驗所選用的PLLA/β-TCP復合人工骨是在常用組織工程骨材料的基礎上，在熔融沉積造型術基礎上選用生物擠壓方法制備的新型可生物降解人工骨。

自然骨是無機納米羥基磷灰石與有機膠原纖維規律結合的產物，具有典型的骨小梁結構，其孔隙率為50%～80%，允許骨母細胞、骨髓間充質干細胞在孔隙里的增殖分化及血管的長入[17]。人體皮質骨的彈性模量和抗彎強度分別為1.0～2.5 GPa及100～200 MPa，松質骨的彈性模量和抗彎強度分別為50～250 MPa及2～20 MPa[18]。PLLA具備良好的力學性能，β-TCP的加入可增加其韌性，本研究中3D打印的PLLA/β-TCP復合人工骨所測得的彈性模量及壓縮強度接近松質骨水平。PLLA/β-TCP復合人工骨的孔徑分布于20～400 μm。Zhao等[19]研究證實多孔材料有利于血管化和新骨沉積的最佳孔徑是400 μm，大于該尺度的孔徑對血管的新生無顯著影響，反而降低材料的機械性能。Kapat等[20]研究表明孔徑大于50 μm的支架有利于氧氣與營養物質的交換并排除代謝廢物，但細胞的黏附率及細胞之間信號傳遞會因此降低，而孔徑小于10 μm時可取得相反的效果。因此，大徑與小徑微孔的結合更能促進血管的新生和骨的生成。

β-磷酸三鈣具有骨引導性，但對其是否具有骨誘導性的觀點目前還不統一[21-22]。有研究認為磷酸三鈣的骨誘導性是由于支架材料的孔隙結構及交通率等幾何因素促進了骨形態發生蛋白等成骨因子的吸附及沉積導致的[23]。Tsukanaka等[24]認為酸性磷酸酶陽性細胞的募集是高純β-磷酸三鈣骨支架具有骨誘導性的關鍵所在。Syed-Picardl[25]研究證實磷酸三鈣是一種具有骨誘導性的材料，它通過釋放鈣離子來改變三維細胞支架的分化模式，釋放的鈣離子可以調節CD43(跨膜蛋白)介導的縫隙連接，增加胞外鈣離子的濃度，誘導細胞的成骨分化。本研究避免材料界面等因素干擾，利用人工骨浸提液培養細胞，早期成骨分化后的ALP染色和晚期成骨分化后的茜素紅S染色結果陽性，提示PLLA/β-TCP復合人工骨具備一定的骨誘導作用。但其作用是有限的，浸提液中鈣離子濃度可能是主要的影響因素之一，復合支架中鈣離子的釋放受人工骨結構強度及浸泡時間的影響。要使人工骨具有明顯的骨誘導性，可以在人工骨中加入骨形態發生蛋白等成分。

對生物相容性的研究常用體外細胞培養法和體內直接植入法(1988年)。本研究中體外細胞培養可見人工骨中細胞生長良好，偽足伸展充分，未見細胞萎縮溶解現象。體內植入實驗組織學檢測提示PLLA/β-TCP復合人工骨早期存在一定的炎癥反應。炎癥反應是活體組織對損傷因子所作出的防御反應，引起可降解支架材料炎癥反應的因素較多，如植入手術引起創傷的范圍、支架的形狀、支架的表面自由能及表面電荷、支架材料的中間降解產物等[26-27]。PLLA/β-TCP復合人工骨在體內植入實驗后的組織學檢測結果符合國家醫療器械的植入后局部反應試驗標準。

由此可見，3D打印的PLLA/β-TCP復合人工骨具備優良的三維多孔結構，力學強度佳，具備良好的細胞相容性及組織相容性，β-TCP的摻入使得復合人工骨具備一定的骨誘導性，是一種理想的可降解組織工程骨材料。然而，3D打印的組織工程骨仍存在諸多問題，如其孔隙率及孔徑精確度有待提高；3D打印可生物降解材料后期的降解速度與生物力學、與成骨成血管匹配的關系有待研究。