XIST/miRNA-34 a信號軸調控結直腸癌細胞SW480放療敏感性的機制研究

付玉娟，殷濤，倪猛，王旸，萬里新

鄭州大學附屬南陽市中心醫院1核醫學科，3消化內科，4放療科，5腫瘤科，河南南陽473000

2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科，武漢430000

結直腸癌的發生、發展受多種因素的影響，包括遺傳因素和環境因素等。據統計，近年來結直腸癌的發病率呈現顯著上升的趨勢[1]。目前，結直腸癌的常用治療手段是手術輔以放化療。放療可以有效殺死腫瘤細胞，延長細胞周期，提高手術治療的效果。但部分患者具有較低的放療敏感性，遠期效果不能達到預期，因此研究放療抵抗的分子機制是目前結直腸癌臨床和基礎研究的重點和熱點。本文研究結直腸癌中長鏈非編碼RNA X染色體失活特異轉錄本（long noncoding RNA X-inactive specific transcript，lncRNA XIST）的表達水平，探討其與放療敏感性的關系及可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

SW480、HT-29、SW620、LOVO細胞均購自中科院典型培養物保藏委員會上海細胞庫，正常結腸上皮細胞NCM460購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）、pcDNA、miRNA-34a模擬物和miRNA-34a抑制劑（anti-miRNA-34a）均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，RNA提取試劑盒、微小RNA（microRNA，miRNA）提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，凋亡檢測試劑盒購自南京博泰生物技術有限公司，野生型XIST（XIST-WT）和突變型 XIST（XIST-MUT）3'-非翻譯區（3'-untranslated regin，3'-UTR）熒光素酶報告載體購自德國Qiagen公司。流式細胞儀、qPCR儀均購自美國ABI公司，細胞培養箱購自美國Thermo Forma公司，倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 標本選取

選擇2016—2018年南陽市中心醫院收治的30例結直腸癌患者的結直腸癌組織及其癌旁組織，所有患者均經病理檢查確診為結直腸癌且未接受放化療，手術切除組織標本后，保存于-80℃冰箱。

1.3 細胞培養及轉染

將結直腸癌細胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）培養于RPMI-1640培養基中，加入10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，待其濃度約為80%，加入胰蛋白酶消化、傳代。將SW480細胞以2×105/孔接種至6孔板中，將轉染siRNA-NC、siRNA-XIST、miRNA-NC、miRNA-34a模擬物、antimiRNA-NC、anti-miRNA-34a、pcDNA-NC、pcDNAXIST的細胞分別作為si-NC組、si-XIST組、miRNANC組、miRNA-34a組、anti-miRNA-NC組、anti-miRNA-34a組、pcDNA組、XIST組；將轉染siRNAXIST+anti-miRNA-NC的細胞作為si-XIST+antimiRNA-NC組，將轉染siRNA-XIST+anti-miRNA-34a的細胞作為si-XIST+anti-miRNA-34a組。待細胞融合度約為80%時，更換為無血清培養基。

1.4 qPCR檢測XIST和miRNA-34 a的相對表達量

采用RNA提取試劑盒和miRNA提取試劑盒提取組織或細胞中總RNA和miRNA，加入逆轉錄酶，合成cDNA。以cDNA為模板進行qPCR。采用Primer 5.0軟件設計引物，XIST上游引物為5'-ACGCTGCATGTGTCCTTAG-3'，下游引物為5'-GAGCCTCTTATAGCTGTTTG-3'；miRNA-34a上游引物為5'-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3'，下游引物為5'-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3'；GAPDH上游引物為5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物為5'-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3'。 以GAPDH為內參，采用 2-ΔΔCt法計算XIST和miRNA-34a的相對表達量。實驗重復3次。

1.5 細胞照射

取si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組培養24 h的細胞，采用2、4、6、8 Gy的放射劑量一次性照射48 h，照射完成后置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養8 h，進行細胞克隆和細胞凋亡實驗。

1.6 細胞克隆實驗

取si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組細胞。當培養板中出現明顯的細胞克隆，棄去培養液，采用4%多聚甲醇固定30 min，結晶紫染色30 min，低倍顯微鏡下觀察細胞數＞50個的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%，存活分數=受照射細胞克隆形成率/未受照射細胞克隆形成率×100%。

1.7 細胞凋亡實驗

將si-NC組、si-XIST組以及si-XIST+anti-miRNA-NC組、si-XIST+anti-miRNA-34a組采用4 Gy照射的細胞接種至6孔板中，培養48 h后棄去培養基，制成單細胞懸液，加入10 μl異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的膜聯蛋白V（Annexin V）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光染色15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.8 XIST靶基因的預測和驗證

通過生物信息學預測軟件TargetScan，按照操作流程預測XIST下游調控的靶基因。經過大量的文獻篩選，選定miRNA-34a作為研究對象。為了進一步驗證XIST與miRNA-34a的靶向關系，構建野生型 XIST（XIST-WT）和突變型 XIST（XIST-MUT）的3'-UTR熒光素酶報告載體，分別共轉染miRNA-34a模擬物和miRNA-34a抑制劑，測定雙熒光素酶的活性。

1.9 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件對-數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XIST相對表達量的比較

XIST在結直腸癌組織中的相對表達量為（3.508±0.594），高于癌旁組織的（1.068±0.076），差異有統計學意義（t=7.057，P＜0.05）。結直腸癌細胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中XIST的相對表達量均高于正常結腸上皮細胞NCM460，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表1）。其中SW480細胞中XIST的相對表達量最高，因此以SW480細胞作為后續實驗的研究對象。

2.2 下調XIST表達對結直腸癌細胞輻射敏感性的影響

si-XIST組SW480細胞中XIST的相對表達量為（0.293±0.020），低于si-NC組的（0.968±0.049），差異有統計學意義（t=22.09，P＜0.05）。si-NC組SW480細胞的凋亡率為（6.553±0.342）%，明顯低于si-XIST組的（23.436±1.401）%，差異有統計學意義（t=20.28，P＜0.01）（圖1）。照射劑量為 4、6、8 Gy時，si-XIST組SW480細胞的存活分數均低于si-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表1 各細胞系中XIST相對表達量的比較（±s）

表1 各細胞系中XIST相對表達量的比較（±s）

注：*與NCM460細胞比較，P＜0.05

細胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVOXIST相對表達量1.086±0.084 4.120±0.368*1.966±0.182*2.123±0.241*3.125±0.323*

2.3 雙熒光素酶報告基因檢測結果

TargetScan數據庫顯示，XIST與miRNA-34a的3'-UTR的部分堿基可互補配對（圖2）。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，miRNA-34a組XISTWT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性低于miRNA-NC組，anti-miRNA-34a組XIST-WT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性高于anti-miRNANC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；miRNA-34a組和miRNA-NC組XIST-MUT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；anti-miRNA-34a組和anti-miRNA-NC組XISTMUT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

圖1 流式細胞儀檢測SW480細胞的凋亡情況

表2 不同照射劑量si-NC組和si-XIST組SW480細胞的存活分數（%）

2.4 miRNA-34 a相對表達量的比較

圖2 TargetScan數據庫預測miRNA-34 a與XIST間的靶向結合位點

表3 不同組別XIST-WT和-XIST-MUT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性（x± s）

miRNA-34a在結直腸癌組織中的相對表達量為（0.482±0.110），低于癌旁組織的（1.146±0.078），差異有統計學意義（t=8.529，P＜0.05）。結直腸癌細胞系SW480、HT-29、SW620、LOVO中miRNA-34a的相對表達量均低于正常結腸上皮細胞NCM460，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表4）。

2.5 XIST與miRNA-34 a相對表達量的關系

qPCR檢測結果顯示，XIST組的miRNA-34a相對表達量為（0.256±0.017），低于pcDNA組的（1.003±0.086），差異有統計學意義（t=14.76，P＜0.05）；si-XIST組的miRNA-34a相對表達量為（3.459±0.352），高于si-NC組的（0.986±0.094），差異有統計學意義（t=11.76，P＜0.05）。

表4 各細胞系中miRNA-34 a相對表達量的比較（±s）

表4 各細胞系中miRNA-34 a相對表達量的比較（±s）

注：*與NCM460細胞比較，P＜0.05

細胞系NCM460 SW480 HT-29 SW620 LOVO miRNA-34a相對表達量0.983±0.099 0.256±0.027*0.593±0.059*0.452±0.046*0.368±0.038*

2.6 anti-miRNA-34 a逆轉si-XIST增強SW480細胞輻射敏感性的能力

照射劑量為2、4、6、8 Gy時，si-XIST組SW480細胞的存活分數均低于si-NC組，si-XIST+anti-miRNA-34a組SW480細胞的存活分數均高于si-XIST+anti-miRNA-NC組，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表5）。si-XIST 組 SW480細胞的凋亡率為（26.330±2.863）% ，高 于si-NC組 的（7.215±0.765）%，差異有統計學意義（t=11.17，P＜0.05）；si-XIST+anti-miRNA-34a組SW480細胞的凋亡率為（14.244±1.467）%，低于si-XIST+anti-miRNA-NC組的（24.132±2.363）%，差異有統計學意義（t=6.158，P＜0.05）。

3 討論

隨著中國物質生活水平的提高以及生活方式的改變，結直腸癌的發病率顯著增加，且患者的病死率較高。有研究者從基因靶向治療探索結直腸癌放療抵抗的作用機制，發現在結直腸癌發生發展的過程中伴隨lncRNA表達的變化[2-4]。lncRNA是一種不編碼蛋白的RNA分子，其表達量具有時間、空間以及組織特異性，在多種疾病中的表達量異常。近年來的研究表明，lncRNA在腫瘤的發生發展過程中發揮癌基因或抑癌基因的作用，調控腫瘤細胞的增殖、侵襲等過程[5-8]。XIST是雌性哺乳動物X染色體轉錄沉默過程中的長鏈非編碼RNA，在X染色體失活過程中發揮重要作用。研究證實，XIST與腫瘤的形成、發展密切相關，降低XIST的表達可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移，促進細胞凋亡，從而發揮抑癌基因的作用[9-10]。在胃癌組織中，XIST表達量上調，且與淋巴結轉移和TNM分期有關[11-12]。在鼻咽癌中，XIST的表達量顯著上調，與細胞的增殖、放療敏感性密切相關[13]。然而，XIST與結直腸癌細胞放療敏感性關系的研究較少。本研究應用qPCR技術檢測XIST基因在結直腸癌組織、癌旁組織以及結直腸癌細胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中的表達情況，結果顯示XIST的表達量在結直腸癌組織和細胞系中均呈現上調，在SW480細胞中表達上調尤其明顯，提示XIST與結直腸癌的發生、發展密切相關。本研究利用RNA干擾技術使SW480細胞中的XIST基因沉默，XIST沉默后增強了SW480細胞的放療敏感性，并誘導了細胞凋亡。

表5 各組SW480細胞的存活分數（%）

miRNA是一類調控基因轉錄或翻譯的非編碼單鏈小RNA，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤的形成等過程[14-17]。越來越多的研究表明，miRNA參與多種腫瘤的發生、發展，在腫瘤預防和診斷中的作用日益被關注。研究表明，miRNA與腫瘤細胞的放療敏感性有關[18-20]。miRNA-34a一種腫瘤抑制因子，其表達量與腫瘤的進展關系密切。研究顯示，miRNA-34a可通過作用于下游靶基因，影響腫瘤細胞的增殖和凋亡[21]。在裸鼠人肺癌移植瘤中，miRNA-34a可通過調節下游靶基因RAD51的表達，增加移植瘤的放射敏感性[22]。然而，miRNA-34a的表達是否對結直腸癌的放療敏感性具有影響以及miRNA-34a在結直腸癌中的作用是否與XIST具有相關性仍不確定。本研究的qPCR檢測結果顯示，miRNA-34a在結直腸癌組織及細胞系（SW480、HT-29、SW620、LOVO）中低表達，在SW480細胞中表達下調較明顯。生物信息學預測結果顯示miRNA-34a可能是XIST的下游靶基因，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，當共轉染miRNA-34a模擬物時，XIST-WT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性明顯受到抑制；當共轉染miRNA-34a抑制劑時，XIST-WT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性增加。無論是共轉染miRNA-34a模擬物還是miRNA-34a抑制劑，XIST-MUT 3'-UTR報告基因的熒光素酶相對活性均無顯著變化，進一步驗證了miRNA-34a與XIST的靶向調控作用。本研究采用qPCR檢測XIST與miRNA-34a的靶向調控作用，結果顯示，上調XIST的表達可抑制miRNA-34a的表達量，下調XIST的表達作用正好相反，表明XIST在結直腸癌SW480細胞中可負向調控miRNA-34a的表達量；抑制miRNA-34a的表達可明顯逆轉下調XIST對SW480細胞放療敏感性的影響，表明XIST通過靶向調節miRNA-34a，調控結直腸癌SW480細胞的放療敏感性。

綜上所述，XIST在結直腸癌組織和細胞系中表達量增加，下調XIST的表達可增加結直腸癌SW480細胞的放療敏感性，抑制miRNA-34a的表達可逆轉該作用。