外周血循環腫瘤細胞對早期胃癌的診斷和預后評估價值

向森，焉然，張開芳

1駐馬店市中心醫院腫瘤內科，河南駐馬店463000

2黃河科技學院醫學院，鄭州450006

早期胃癌（early gastric cancer，EGC）是指腫瘤浸潤深度在黏膜及黏膜下層者，其預后與胃癌分期密切相關，早期發現可改善患者預后[1]。然而，約5%的EGC患者術后會發生轉移或復發[2]。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是逃過免疫監視，自腫瘤原發部位經淋巴管或直接進入血液循環的腫瘤細胞[3]。研究發現，包括EGC在內的多種腫瘤早期即有CTC侵入外周血[4]。由于胃癌高發人群對該病的重視程度不夠，加之使用胃鏡大規模篩查EGC具有耗時長、難度大、費用高等缺點，中國胃癌的早期發現率遠低于日本[5]。2012年，美國Cell Search檢測系統經原國家食品藥品監督管理局批準在中國上市，使便捷、無創地早期診斷EGC成為可能[6]。本研究旨在探討CTC對EGC的診斷和預后評估價值，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2015年6月于駐馬店市中心醫院經胃鏡檢查發現胃黏膜病變、疑似EGC的189例患者作為研究對象。納入標準：①經胃鏡檢查發現胃黏膜病變，疑似EGC；②系首次診斷。排除標準：①病理診斷為進展期胃癌者，即胃癌浸潤深度超過黏膜下層；②具有其他腫瘤病史的患者。經病理診斷，189例患者中，64例為EGC患者，125例為非EGC患者（胃潰瘍89例，慢性胃炎36例）。EGC患者中，男44例，女20例；年齡為32～68歲，中位年齡為56歲。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 CTC檢測方法

Cell Search系統及其配套試劑均購自美國強生公司。空腹采集患者靜脈血7.5 ml，置于儲存管（Cell Save管）中，為減少上皮細胞的干擾，須在血常規或生化檢查血樣采集之后采集，采集后立即送檢。將儲存管中的血樣全部倒入預處理管（Cell Tracks Auto Prep錐形管）內，管內含有磁珠標記的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體，再加入6.5 ml枸櫞酸鈉緩沖液，輕柔地顛倒混勻，2000 r/min離心10 min后即可上機檢測。Cell Search系統可利用磁場富集和固定Ep-CAM+細胞。依次加入藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的抗CK81和CK9抗體，異藻藍蛋白（allphycocyanin，APC）標記的抗CD45抗體，最后加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），避光孵育20 min使細胞核著色。染色完畢后，使用Analyzer系統進行熒光掃描，系統自動選取符合腫瘤細胞形態且有紅色標記（CK+）的細胞進行人工判讀，CK+DAPI+CD45-的細胞即為CTC陽性。

1.3 診斷、治療及隨訪

EGC的診斷和治療參考2013年版《NCCN胃癌臨床實踐指南》[7]。所有EGC患者均行腹腔鏡下胃大部切除術和淋巴結清掃術，再根據患者情況決定是否行輔助化療。采取電話、門診等方式進行隨訪，所有患者均隨訪3年，隨訪截止時間為2018年6月。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，數據均為計數資料。四格表資料的比較采用Pearson χ2檢驗、連續性校正法或Fisher確切概率法；當20%以上單元理論頻數值小于5時，3×2列聯表的比較采用似然比χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC檢測結果與病理診斷結果的對照

189例患者中，24例患者的CTC呈陽性，均為EGC患者。CTC診斷EGC的靈敏度為37.50%（24/64），特異度為100%（125/125），陽性預測值為100%（24/24），陰性預測值75.76%（125/165），準確率為78.84%（149/189）。（表1）

2.2 不同臨床特征EGC患者CTC表達情況的比較

表1 CTC檢測結果與病理診斷結果的對照

CTC陽性與CTC陰性EGC患者的淋巴結轉移情況、脈管癌栓情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）；CTC陽性與CTC陰性EGC患者的性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 不同臨床特征EGC患者預后的比較

表2 不同臨床特征EGC患者CTC表達情況的比較

隨訪3年，所有患者均生存，無死亡病例，其中5例患者復發或轉移，59例患者未復發或轉移。不同性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型的EGC患者的復發或轉移情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；CTC陽性、有淋巴結轉移、有脈管癌栓的EGC患者的復發或轉移率均高于CTC陰性、無淋巴結轉移、無脈管癌栓的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征EGC患者預后的比較

3 討論

1869年，Ashworth[8]首次在腫瘤患者血液中檢測到一種與腫瘤細胞相似的細胞，并首次提出了CTC學說。隨著近年來CTC檢測技術的進步，越來越多的腫瘤早期血行轉移證據被發現，而CTC被認為是EGC遠處轉移的直接原因[9]。Joosse等[10]研究認為，CTC可檢出直徑1 mm的腫瘤，而一般影像學檢查只能檢出直徑10 mm左右的腫瘤。雖然胃鏡對胃癌的檢出率較高，但也可由于操作者熟練程度不佳、病灶微小取材不準等原因導致誤診[11]。因此，CTC成為了胃癌早期診斷的一個研究方向。

既往報道多將各期胃癌作為整體研究，對所有分期的胃癌進行CTC檢測，檢查CK和EpCAM，檢測方法包括免疫學方法和逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）[12]，其靈敏度為 25%～82%[13-14]。本研究采用Cell Search系統檢測EGC患者的CTC表達情況，結果顯示，64例EGC患者中，僅24例患者CTC呈陽性，125例非EGC患者的CTC均呈陰性，靈敏度為37.50%，特異度為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為75.76%，準確率為78.84%。說明Cell Search系統對EGC的診斷效能顯著低于胃鏡活檢，不適合作為診斷EGC的主要手段，與王振丹[15]的研究結果類似。有研究指出，發生血行轉移的腫瘤細胞多已發生上皮-間充質轉化，其細胞表面不再表達或下調表達黏蛋白抗原，因此Cell Search系統利用EpCAM抗體進行CTC富集是有缺陷的[16]。近年來，CTC檢測技術不斷發展，多種標志物聯合檢測有助于提高EGC的診斷效能[17]。Cyttel?-CTC檢測技術的診斷效能較高，使用范圍較廣，其通過陰性富集法去除血液中99.99%以上的白細胞，基本保證了血液CTC無損地富集，腫瘤細胞在表面抗原、核染色體及形態等方面的變化對檢測無干擾[18]。

黃寶俊等[19]對629例EGC患者進行長期隨訪，結果顯示，31例（4.9%）患者因腫瘤復發或轉移而死亡，其中血行轉移占54.8%，最常見于肝臟和腦轉移，且多發生在術后3年內。Msaouel和Koutsilieris[20]的研究認為，多數CTC會因機體免疫或環境不適應而凋亡，僅少數具有器官親嗜性或活力較強的細胞可以存活下來，經血液或淋巴結實現腫瘤轉移。本研究中，術后3年發生肝轉移4例，復發1例，與上述研究結果一致。淋巴結轉移是胃癌最常見的轉移途徑，本研究分析了不同臨床特征EGC患者的CTC表達情況，結果發現，有淋巴結轉移和脈管癌栓患者的CTC均為陽性；CTC陽性與CTC陰性EGC患者的性別、年齡、腫瘤位置、浸潤深度、分化程度和大體病理類型比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。提示EGC患者的CTC可能來源于淋巴結轉移的腫瘤細胞。既往研究報道，淋巴結轉移和脈管癌栓均是EGC預后不良的獨立危險因素[21]，與本研究結果類似。本研究中，復發或轉移的5例患者均為CTC陽性，提示CTC可作為EGC患者淋巴結轉移的輔助檢查手段，并可能作為預后不良的獨立預測因素，與Brungs等[22]的研究結果類似。當CTC陽性時，EGC患者預后不良的可能性較大，采取與高危患者相同的化療方案可能會使患者獲益。

綜上所述，應用Cell Search系統檢測CTC對EGC的診斷效能較低，但可作為淋巴結轉移和預后不良的參考指標。