常壓室溫等離子體誘變選育高產油脂皮狀絲孢酵母的研究

許鵬飛，郭金玲,2，呂育財,2，涂 璇,2，龔大春,2

(1.三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002； 2.三峽大學湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002)

微生物油脂是利用酵母菌、藻類、霉菌等微生物在一定生長條件下，通過代謝在體內積累所產生的一種特殊油脂，其主要成分為甘油三酯(TAG)，在組成上與植物油相似，以C16和C18為主[1]。微生物油脂可以作為生物柴油的原料，其產油微生物可實現大規模培養。但目前微生物油脂的產量不高，高產菌株的選育成為微生物油脂產業化的瓶頸[2-3]。

常壓室溫等離子體(ARTP)誘變育種技術是通過氦氣大氣壓射頻輝光放電，產生系列活性氧化物和活性氮化物等離子體，攻擊微生物DNA，引起DNA的磷氧鍵和氮氧鍵斷裂，實現DNA重組，從而產生突變體的一種新技術。該技術操作在常壓室溫下進行，具有活性粒子種類多樣、成本低、使用簡便、安全性高、無污染、突變譜廣、突變率高等優勢，被廣泛用于酵母、霉菌等微生物的生物育種[4]。

建立高效的高產油脂菌株的篩選方法是ARTP誘變育種研究重點[5-6]。王美珠[7]研究發現，在酵母脂肪酸合成途徑中，蘋果酸酶是產油代謝途徑中的關鍵性酶，而芝麻酚是蘋果酸酶的抑制劑，如果將芝麻酚加入培養基中則可以抑制蘋果酸生成丙酮酸和NADPH，從而抑制脂質積累[8-9]，由此可用于誘變菌株的初篩。Kimura[10]、林義[11]等報道利用尼羅紅熒光染色測量油脂的方法，具有較高的準確率，如果采用熒光酶標儀可望實現多孔板的高通量篩選。

因此，本文使用ARTP誘變儀對皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)進行處理后，通過添加一定質量濃度的芝麻酚抗性標記初篩，然后將初篩菌株接種到多孔板培養后進行尼羅紅熒光檢測高通量篩選，得到增殖迅速、油脂產量高的優勢突變菌株，并對其遺傳穩定性和菌株油脂成分開展進一步研究，為后續的發酵培養優化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)，來自三峽大學艾倫麥克德爾米德研究所；氯仿、甲醇、尼羅紅等均為分析純；十六烷酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯標準品，購于TMRM公司。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變儀，Tecan Infinite?200 Pro多功能酶標儀，福立GC9720氣相色譜儀。

平板培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂粉 20 g/L。

種子液培養基：蔗糖 25 g/L，酵母浸膏 6 g/L，麥芽浸粉 5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，1×105Pa滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖 60 g/L，酵母浸膏 6 g/L，麥芽浸粉 5 g/L，Na2HPO44 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養

將保存的原始菌株接種到斜面中，30℃培養3 d。然后將斜面上的菌種取1環接種到100 mL種子液中，在28℃、200 r/min的搖床中培養18 h。

1.2.2 高產菌株ARTP誘變篩選

將培養好的菌株，先進行ARTP誘變條件的優化，然后通過芝麻酚抗性標記進行初篩，挑選優勢菌落，接種到多孔板中培養，通過添加尼羅紅熒光試劑，挑選熒光強度大的菌株，經搖瓶培養，提取油脂，氣相檢測，得到優勢菌株。具體流程如下。

1.2.3 誘變致死率計算

先將種子液制成OD600值為1.0的菌懸液，將ARTP誘變儀的溫度保持在20℃，調節功率為120 W,氦氣流量為10 L/min[11]。吸取10 μL菌懸液點到已用酒精灼燒30 s的金屬載片上，將載片放入到誘變室內，發射體距離菌懸液2 mm，使用不同的時間(0、10、20、30、40、50、60 s)進行誘變處理，將誘變的菌體放入1 mL的生理鹽水中振搖1 min，取100 μL涂布到平板培養基上28℃培養2 d，計算致死率。

1.2.4 芝麻酚質量濃度篩選

配制62.5 mg/mL的芝麻酚溶液，分別添加0、40、80、120、160 μL到50 mL的平板培養基中，最終質量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL。將OD600值為1.0的菌懸液取100 μL涂布到含芝麻酚的抗性平板上，28℃培養2 d，觀察菌體生長情況。

1.2.5 優勢菌株的高通量篩選

先將平板上誘變的菌株用竹簽接種到48孔1 mL 的液體培養基中，在30℃、200 r/min的微孔板恒溫搖床中培養，每隔24 h，取150 μL菌液到96孔板中用酶標儀檢測600nm處的吸光度，測定生物量。

每個孔板添加7.5 μL尼羅紅染液，混合均勻，避光染色5 min，用酶標儀以485 nm的發射波長、595 nm的吸收波長檢測細胞油脂熒光強度，以沒有添加尼羅紅染液的熒光強度為空白對照，篩選出油脂含量高的誘變菌株。

1.2.6 發酵培養

將篩選得到的高油脂含量的菌株和低油脂含量的菌株分別接種到種子液中培養18 h，取10%種子液接種到發酵培養基中28℃、200 r/min培養，每隔24 h檢測菌株濃度和油脂含量，連續檢測10 d。

1.2.7 油脂提取

將發酵培養90 h的菌液8 500 r/min離心10 min，將菌體放到已烘干稱重的試管中，一起放入80℃烘箱中烘干至恒重，計算菌體得率。每克干菌體加入適量 8 mol/L的鹽酸，混合均勻后室溫靜置1 h，沸水浴處理10 min，迅速冷卻，恢復到常溫后加入2倍體積的氯仿-甲醇(體積比2∶1)溶液，混勻后室溫靜置30 min，于4 500 r/min離心10 min。萃取得氯仿層，上層溶液再加10 mL氯仿，振蕩均勻，離心，進行二次萃取得氯仿層，合并氯仿層。旋轉蒸發除去氯仿得油脂，稱重。

1.2.8 遺傳穩定性分析

將誘變菌株在平板培養基上連續傳代10次，再進行發酵培養，檢測菌株的熒光強度變化，研究其遺傳穩定性。

1.2.9 油脂脂肪酸組成分析

取1 mL油脂放入15 mL離心管中，加入3 mL正己烷，浸潤提取15 min后，再加入0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液1 mL，振蕩搖勻后放于50℃水浴15 min左右，取出后沿管壁加入5%NaCl溶液，靜置分層后，用注射器取其上層清液，經過濾后加入1.5 mL的氣相色譜樣品瓶內，進行氣相分析。氣相分析條件參考朱啟思等[12]方法進行檢測。

2 結果與討論

2.1 ARTP誘變時間對Trichosporon cutaneum致死率的影響

研究表明，等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結構及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網絡顯著變化，最終導致微生物產生突變[13]。誘變時間和強度對微生物致死率的影響較大。致死率過低或過高都不利于篩選。本實驗采用1.2.3的方法，在不同誘變時間下，考察皮狀絲孢酵母的致死率與時間關系，結果見圖1。

圖1 皮狀絲孢酵母ARTP致死率曲線

從圖1可以看出，ARTP對Trichosporoncutaneum的殺傷力較強，致死率在10～40 s之間呈現直線增長方式，經35 s 誘變后菌體致死率為80%左右， 40 s 的時候致死率就達到了95%左右，當誘變時間達到60 s的時候，菌體基本上全部不能存活。為了保證一定的正負突變率，選擇一定的誘變時間至關重要。因此，選擇致死率達到95%左右的40 s為最佳誘變時間。

2.2 芝麻酚質量濃度對誘變菌株生長的影響

選取不同質量濃度芝麻酚，按照1.2.4方法進行研究。不同質量濃度芝麻酚對Trichosporoncutaneum生長的影響如圖2所示。

圖2 不同質量濃度芝麻酚對Trichosporon cutaneum生長的影響

從圖2可以看出，芝麻酚能抑制Trichosporoncutaneum菌株的生長。在低質量濃度(0.05 mg/mL)時，抑制作用較小，當芝麻酚質量濃度達到0.1 mg/mL時，菌落數量明顯減少，生長受到抑制作用，菌落形態也發生了一些變化。當芝麻酚質量濃度達到0.15 mg/mL時，抑制大大增強，菌落數量大幅減小。若繼續加大芝麻酚質量濃度，菌株停止生長。為了保證菌株的生長情況較好，又便于篩選，選取0.15 mg/mL的芝麻酚作為篩選培養基中的最佳質量濃度，用于芝麻酚抗性標記篩選。

2.3 ARTP誘變高通量菌株篩選

綜合考慮ARTP致死率情況和芝麻酚的抑制效果，將OD600值為1.0的種子菌懸液，用ARTP誘變儀以120 W的功率處理40 s，再將誘變的菌株涂布到含有0.15 mg/mL芝麻酚的平板培養基上28℃培養2 d。挑選生長旺盛的40個單菌落菌株用無菌竹簽接種到48孔培養基中，每隔24 h檢測菌株濃度和熒光強度。圖3顯示了原始菌株熒光強度為1.0時，40個誘變菌株培養6 d時的相對熒光強度。

圖3 誘變菌株的相對熒光強度

從圖3可以看出，大多數誘變菌株的熒光強度低于原始菌株(W)，但有兩株誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8的熒光強度高于原始菌株20%以上。同時也有熒光強度比原始菌株低很多的，其中菌株C2最低，說明其脂肪酶合成途徑的關鍵基因受到極大影響，為了驗證熒光強度與油脂積累的關系，以及為了后期探究誘變菌株基因層面上的變化，特將正突變誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8和負突變誘變菌株TrichosporoncutaneumC2同時進行進一步復篩，為后期的進一步發酵和基因水平的比較做準備。

2.4 誘變菌株的發酵培養復篩

將誘變菌株TrichosporoncutaneumA1、E8、C2和原始菌株(W)進行種子液和搖瓶發酵培養，每天檢測熒光強度，進行復篩, 其10 d的檢測結果如圖4所示。

圖4 誘變菌株與原始菌株的熒光強度隨時間的變化

從圖4可以看出，初篩得到的優勢菌株TrichosporoncutaneumA1、E8在搖瓶發酵中的熒光強度明顯高于原始菌株，菌株熒光強度增加較快，預示著誘變菌株的脂質積累量較大，在發酵9 d時的熒光強度達到最大，為原始菌株的300%左右，負突變誘變菌株C2的脂質積累一直低于原始菌株且積累緩慢。

為了進一步驗證誘變菌株的油脂積累情況，將這4個菌株搖瓶培養9 d后，按照1.2.7的方法提取細胞內油脂，分析其生物量、油脂產量和含量變化，結果如表1所示。

表1 皮狀絲孢酵母誘變菌株的復篩結果

由表1可知，經誘變篩選的誘變菌株TrichosporoncutaneumA1比TrichosporoncutaneumE8綜合指標好，較原始菌株產油脂能力有了很大提高，其生物量、油脂產量、油脂含量分別提高了41.6%、123.1%、57.4%。在搖瓶培養中，TrichosporoncutaneumA1的油脂產量達到了5.8 g/L，遠高于原始菌株，而負突變誘變菌株C2油脂產量下降26.9%。由此可見，本篩選方法用于優勢誘變菌株篩選是行之有效的。

2.5 遺傳穩定性

為了檢驗優勢誘變菌株TrichosporoncutaneumA1能否保持穩定的遺傳特性，將誘變菌株A1連續傳代培養10次，并同時進行發酵培養，檢測菌株的熒光強度, 結果如圖5所示。

圖5 誘變菌株A1連續傳代10次的熒光強度

從圖5可以看出，從第1代到第10代誘變菌株A1的熒光強度基本保持穩定，傳代至第10代，誘變菌株A1的熒光強度仍然能達到第一代的90%，可見誘變菌株具有良好的遺傳穩定性，能穩定生產油脂。

2.6 油脂脂肪酸組成

對誘變菌株TrichosporoncutaneumA1所產油脂用氣相色譜法進行脂肪酸組成測定，結果如表2所示。

表2 原始菌株和誘變菌株A1的脂肪酸組成及含量 %

從表2可以看出，誘變前后菌株中的油脂脂肪酸組成相同。而誘變菌株A1的油脂脂肪酸含量與原始菌株相比，十六烷酸、硬脂酸、亞油酸的相對含量略有提高，而油酸的相對含量下降了3.89個百分點，其變化的原因有待進一步研究。

3 結 論

本文建立了芝麻酚初篩和尼羅紅熒光多孔板檢測的高通量篩選策略。經過ARTP的40 s誘變后，接種到質量濃度為0.15 mg/mL的芝麻酚培養基中28℃培養2 d，篩選出生長旺盛的菌株，然后接種到48孔液體培養基培養，并利用96孔板尼羅紅熒光染色對培養菌株進行高通量篩選，選育出一株高產油脂菌株TrichosporoncutaneumA1。該菌株較原始菌株的生物量、油脂產量、油脂含量分別提高了41.6%、123.1%、57.4%，且具有良好的遺傳穩定性；通過氣相色譜分析,其油脂脂肪酸組成與原始菌株相同，主要為十六烷酸、硬脂酸、油酸、亞油酸。

本文通過將ARTP隨機誘變與芝麻酚定向抑制微生物產油代謝途徑中的關鍵酶相結合，增大誘變菌株向油脂積累方向突變的機會，使篩選到優良菌株的概率升高，減少篩選的工作量，為油脂酵母的選育提供了高效的篩選方法，可為其他產油脂菌株的篩選提供重要參考。誘變后所產生的正負突變誘變菌株在基因水平的變化和關鍵酶的影響有待進一步研究。