正交實驗法優化白花蛇舌草中三萜類成分的提取工藝

陳麗娜，劉春明，楊曉靜

(長春師范大學中心實驗室，吉林長春 130032)

白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)，系茜草科耳草屬植物[1]。別名蛇舌草、蛇利草、蛇總管、鶴舌草、龍舌草等。常以全草供藥用，具有清熱解毒、消癰、利濕通淋的功效，常用于治療各種腫瘤及炎癥[2]。藥理研究發現白花蛇舌草中三萜類化合物作為其中的活性成分之一，具有抗腫瘤、抗菌、護肝、免疫調節等方面的活性[3]。關于白花蛇舌草中三萜類化合物的提取工藝的研究尤為重要。謝艷、丁博等[4-5]采用溶劑回流提取法粗提并結合有機溶劑萃取，初步提取并測定了白花蛇舌草中的三萜類化合物的含量，該方法提取時間長，溶劑耗費多且在萃取時涉及有毒的有機溶劑。陸慧等[6]通過正交試驗對白花蛇舌草中的三萜類化合物的超臨界CO2萃取工藝進行優化，萃取率雖然較前者有所提高，但耗費時間長。張才華等[7]利用索氏提取方法提取了白花蛇舌草中兩種三萜類成分——齊墩果酸和熊果酸，該方法以氯仿為溶劑，耗費8 h，同樣存在耗時長、有機溶劑使用量大的問題。

1995年，Richter等[8]提出了一種全新的萃取方法——加速溶劑萃取法(Accelerated Solvent Extraction, ASE)。該方法是通過提高溫度和增加壓力來進行有機溶劑的自動萃取，具有有機溶劑用量少、萃取快速、樣品回收率高等突出優點，被美國環保局(EPA)推薦為標準方法[9]。

本文首次引入加速溶劑萃取法(ASE)提取白花蛇舌草中的三萜類化合物，通過正交試驗并結合簡單可行的紫外分光光度法定量，最終得到加速溶劑提取的最佳提取工藝。在提高提取率的基礎上，節省了大量的溶劑和時間，通過重復試驗進一步驗證了此方法的穩定性和可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

加速溶劑萃取裝置(戴安中國有限公司，ASE-150)；旋轉蒸發儀(德國，Heidolph)；紫外分光光度計(日本島津有限公司，UV-2450)。

1.2 試劑

白花蛇舌草(河北保定同仁堂，長春師范大學中心實驗室王晶鑒定)；齊墩果酸標準品(純度≥98.5%,購自aladin)；無水乙醇(分析純，購自北京化工廠：配置成不同體積分數待用)；甲醇(色譜級，美國Thermo Fisher公司)；實驗用水為超純水(LaboStarTMTWT UV7，美國SIEMENS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 總三萜的測定

以齊墩果酸為標準品，利用紫外分光光度法測定總三萜含量，測定波長為203 nm。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對照品10.0 mg置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，搖勻，既得(每毫升含齊墩果酸對照品1.0 mg)。

1.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取白花蛇舌草粉末2.0 g置于ASE提取釜中，以ASE法進行提取。提取溶劑為90%的乙醇，提取溫度為80℃，提取時間為10 min，提取次數為3次。合并提取液，減壓濃縮至干，用4 mL甲醇溶解，稀釋1000倍，待測。

1.3.4 方法學研究

取上述齊墩果酸對照品溶液，用甲醇逐級稀釋，制備齊墩果酸質量濃度分別為0.004、0.008、0.010、0.015、0.020、0.030、0.040 mg·mL-1的標準品溶液。取濃度為0.030 mg·mL-1的標準品溶液在200～400 nm范圍內進行掃描，確定齊墩果酸的最大吸收波長為203 nm。在最大吸收波長處分別測定上述標準品的吸光度，以質量濃度X(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度Y為縱坐標進行回歸分析，制備齊墩果酸的標準曲線。取濃度為0.020 mg·mL-1的齊墩果酸標準品溶液連續3次測定吸光度值，考察方法的精密度。分別準確稱取同一批次白花蛇舌草藥材粉末3份，按1.3.3方法制備并測定其總三萜含量，考察方法的重復性。取同一供試品溶液，在一天內，每隔4 h測定一次吸光度值，考察方法的穩定性。

1.3.5 提取工藝研究

選擇乙醇體積分數(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)及提取次數(D)這4個因素為考察因素，每個因素選擇3個水平，以L9(34)正交設計表安排實驗，以總三萜的含量為評價指標。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.6 總三萜含量的計算

按照公式(1)對白花蛇舌草提取物中總三萜含量進行測定。

(1)

其中，A為供試品溶液的吸光度；本實驗稀釋倍數為4000倍；粗粉質量均為2.0 g。

2 結果與討論

2.1 總三萜含量的測定

齊墩果酸的標準曲線見圖1，相關系數R為0.9982，表明線性關系良好。精密度實驗的相對標準偏差RSD為0.16%(n=3)，表明儀器精密度良好。重復性實驗的相對標準偏差RSD為0.98%(n=3)，表明方法的重現性良好。穩定性實驗的RSD為0.36%(n=6)，表明供試品溶液中總三萜的含量在24 h內基本穩定。

圖1 齊墩果酸的標準曲線

2.2 提取工藝研究

分別精密稱取白花蛇舌草粉末2.0 g，按正交表的設計進行實驗，用紫外分光光度法測定三萜類化合物的含量，并進行方差分析，結果見表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗結果分析表

表3 正交試驗方差分析表

方差分析結果表明，應用加速溶劑萃取法提取三萜類化合物時，提取效率的影響因素大小順序依次為：提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>提取次數。由正交實驗表可以看出，最佳提取工藝組合為A2B2C3D1，即提取溫度為80℃，提取時間為15 min，乙醇體積分數為90%，提取次數為1次。

2.3 總三萜的提取率

根據2.2所確定的最佳提取工藝，對白花蛇舌草中總三萜進行提取，按公式(1)進行計算。2.0 g白花蛇舌草中三萜類化合物的提取量為112.77 mg·g-1，提取率為11.3%。

3 結論

本文通過正交試驗研究了乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取次數對加速溶劑萃取法提取白花蛇舌草中三萜類化合物提取率的影響。結果表明，各因素的影響順序依次為：提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>提取次數，最佳提取工藝組合為：提取溫度為80℃，提取時間為15 min，乙醇體積分數為90%，提取次數為1次。在此條件下，白花蛇舌草中三萜類化合物的提取率達11.3%(w/w)。加速溶劑萃取—紫外分光光度法聯用技術可以用于快速分析白花蛇舌草中總三萜類化合物含量。與其它提取方法相比，此方法提取率高，操作簡便快捷,節省溶劑且穩定性好，是應用前景較好的提取方法之一。