拉莫三嗪血藥濃度檢測方法構建與干擾因素研究

宋喚春 葉素紅 王凱旋 仝淑花?

癲癇是最常見而嚴重的神經系統疾病之一，流行病學調查顯示，我國現有＞900萬癲癇患者，患病率達7‰，且以每年新發40～60萬例的速度遞增［1］。使用抗癲癇藥物是主要的治療方法，拉莫三嗪（LTG）作為第二代廣譜抗癲癇藥物，是復雜部分性發作的首選藥物，對于特發性全面性癲癇丙戊酸治療失敗后的全身強直-陣攣發作，拉莫三嗪亦為首選藥物［2］。LTG穩態時最高血藥濃度個體差異性大，血藥濃度易受其他合并用抗癲癇藥物影響，皮疹發生率高且不能預測是否嚴重危害生命［3-6］。LTG血藥濃度的監測利于優化LTG給藥劑量實現個體化給藥，并能有效避免不良反應發生。作者應用高效液相色譜檢測LTG血藥濃度，并對其影響因素進行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜系統（G1322A在線脫氣機，G1311C泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD檢測器和Chem32工作站）；電子天平（Mettler Toleto ML204/02）；超聲波清洗機（JP-100/S 機械-數碼）；離心機（xiang yi H-1650R）；氮吹儀（天津艾維歐PHC-010）。

1.2 藥品與試劑 LTG對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：100775-200401）；非那西丁對照品（內標，IS，中國藥品生物制品鑒定所，批號：100095-198904）； 乙 腈（Tedia. United states of America，AS1122-001，HPLC專用）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20110415，HPLC專用）：甲酸銨、三乙胺、硫酸鋅（分析純）；水為超純水并使用0.45μm濾膜再次過濾。40mM甲酸銨配制：稱取甲酸銨1.00g加入400ml超純水超聲溶解，0.45μm濾膜抽濾備用；0.25%三乙胺配制：量取200ml超純水，加入500μl三乙胺超聲混勻備用；5%ZnSO4-MeOH溶液配制：稱取1.00g ZnSO4加入20ml甲醇超聲溶解，因靜置24h便有沉淀析出，因此使用時需新鮮配制。

1.3 標準溶液配制 （1）LTG標準液配制：精密稱取LTG對照品適量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容為500μg/ml儲備液。將LTG儲備液稀釋成1，2.5，5，10，25，50，100，250，500 μg/ml質量濃度的標準液，儲備液及標準液儲存于4℃冰箱中。（2）內標溶液配制：精密稱取非那西丁對照品適量，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容為1mg/ml儲備液，將非那西丁儲備液稀釋為100μg/ml內標標準液，儲備液及標準液儲存于4℃冰箱中。

1.4 LTG血藥濃度檢測方法的構建 （1）色譜條件：色譜柱：Agilent Exlipse XDB-C18（4.6×150mm，5μm）；柱溫：25℃；流動相比例：40mM/L甲酸銨-乙腈-0.25%三乙胺（70：20：10，V/V）；流速：1ml/min；檢測波長：0～8.5min 306nm（LTG）；8.5～12min 250nm（內標）。（2）血漿樣本處理：精密吸取300μl血漿樣品置10ml玻璃具塞試管中，加入30μl內標標準液，渦旋10s，加入300μl蛋白沉淀劑（5%ZnSO4-MeOH），渦旋30s，加入2ml萃取液（乙酸乙酯：正己烷=4：1），繼續渦旋1min后，離心10min（4000r/min）后靜置1min，取其上清液置10ml尖頭玻璃離心管，水浴空氣吹干30min，甲醇200μl復溶，用0.45μm針筒式微孔濾膜濾過，濾液置高效液相色譜樣品瓶中，設置10μl進樣。（3）標準曲線制備及最低定量限測定：吸取270μl空白血漿置10ml玻璃具塞試管中，分別加入不同濃度LTG標準液使總體積為30μl，渦旋10s，使血藥濃度相當于0.1，0.25，0.5，2.5，1，5，10，25，50μg/ml的血漿標準液，以不同濃度LTG血藥濃度峰面積As和內標峰面積Ai之比計算Y，以Y值為縱坐標，LTG濃度X為橫坐標進行線性回歸。（4）回收率測定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質控濃度）LTG血漿標準液測定；配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質控濃度）LTG甲醇標準溶液測定。血漿標準液與甲醇標準液峰面積比計算萃取回收率；將所測血漿標準液峰面積As和內標峰面積Ai之比代入標準曲線計算LTG血藥濃度，以標準曲線計算值與加入值之比計算方法回收率。精密吸取300μl空白血漿置10ml玻璃具塞試管中，加入30μl內標標準液，測定記錄峰面積；精密吸取300μl甲醇溶液加入30μl內標標準液測定記錄峰面積。以血漿中內標峰面積與甲醇中內標峰面積之比計算內標提取回收率。（5）精密度測定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質控濃度）LTG血漿標準液各10份，1d內連續測定10次計算日內精密度；連續測定5d計算日間精密度。（6）穩定性測定：配制0.25，5，50μg/ml（低、中、高質控濃度）LTG血漿標準液，分為若干份，各濃度取1份處理后置進樣器中，于0，1，6，12，24h進行檢測，計算進樣瓶內穩定性；各濃度取5份存于4℃冰箱中，于1，2，3，5，7d進行檢測，計算冷藏穩定性；各濃度取6份存于-40℃冰箱中，于1，7，15，30，60，90 d進行檢測，計算凍融穩定性。

1.5 血漿與全血中LTG濃度比較 抽取患者靜脈血≥2ml置肝素試管送檢（以下簡稱患者血樣）。本試驗將患者血樣分為2份，一份渦旋混勻30s，取全血300μl待測，另一份離心10min（4000r/min）后取血漿300μl待測，兩份樣本處理后進行測定。

1.6 常見抗癲癇藥物的干擾 將卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達唑侖共10種抗癲癇藥物加入到LTG血漿標準品中，處理后進行測定。

1.7 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。進行雙側配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 方法專屬性與其他藥物干擾 本方法色譜系統條件下，LTG和內標的保留時間分別約7.2min和10.8min，專屬性實驗表明LTG與內標峰分離良好，且不受血漿中內源性物質不影響，干擾性試驗表明LTG測定亦不受卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達唑侖等常見抗癲癇藥物的影響，色譜圖見圖1。

圖1 HPLC法測定LTG濃度色譜圖

2.2 標準曲線及檢測限 LTG在0.1～50μg/ml范圍線性良好，直線回歸方程為Y=0.01785218X-0.0078585，相關系數r=0.9996。LTG定量下限為0.1μg/ml。

2.3 回收率 見表1。

表1 LTG提取回收率與相對回收率

2.4 精密度 LTG日內日間精密度RSD均≤6.4%，見表2。

表2 LTG日內與日間精密度

2.5 穩定性 LTG血漿樣本處理后置進樣瓶內存放1日內檢測RSD≤5.89；4℃冷藏1周內檢測RSD≤6.14；-40℃保存3個月內凍融后檢測RSD≤8.57，因此LTG樣本在此三種儲藏方式中均表現出良好的穩定性，可以滿足臨床樣本的檢測要求。

2.6 血漿與全血中LTG濃度比較 選取本院2015年4月份共20例患者血樣同時進行血漿和全血中LTG濃度檢測，測定結果經雙側配對t檢驗分析，配對t值為3.880，P值（雙側）＜0.01，血漿和全血中LTG濃度差值非0無統計學意義，因此同一血樣血漿和全血中LTG濃度無差別。見表3。

表3 LTG血漿中濃度與全血中濃度比較（μg/ml）

2.7 臨床應用 收入本院2015年4月份使用拉莫三嗪片日給藥劑量為50～200 mg（符合拉莫三嗪片藥品說明書用法用量要求）患者30例，24例患者血漿LTG濃度在1～8μg/ml有效濃度范圍［4］內，分別有3例患者血漿LTG濃度＜1μg/ml和＞8μg/ml。3例血漿LTG濃度＞8μg/ml患者均聯合使用丙戊酸鈉緩釋片，1例血漿LTG濃度＜1μg/ml患者合并使用卡馬西平片，可見丙戊酸鈉使LTG血漿濃度升高，而卡馬西平使LTG血漿濃度下降，與文獻［5，7-8］報道一致。服用不同日劑量拉莫三嗪片血漿LTG濃度分布情況。見表4。

表4 不同日劑量拉莫三嗪片血漿LTG濃度分布情況

3 討論

本研究以乙腈和水作為流動相，加入甲酸銨、三乙胺有效改善色譜峰拖尾現象。流動相中三乙胺濃度輕微變化極易引起PH變動，影響色譜峰峰形，加入甲酸銨削弱了這種敏感性，配制流動相時不需要PH計精確測定，簡化配制過程。參照張杰等［9］血漿中LTG濃度檢測方法，采用非那西丁做為內標物質（非那西丁為市場淘汰藥物），因不被患者所使用，不存在內標被干擾問題。LTG具有在190～250nm范圍及310nm處有較大紫外吸收的特性，但在190～250nm處不僅血漿中有較多雜質具有紫外吸收較多常見并用藥物（卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉等）也有較強紫外吸收，本研究采用310nm紫外吸收波長檢測LTG，250nm波長檢測內標（非那西丁最大吸收），不受血漿雜質及其他合用抗癲癇藥物影響。

本資料結果表明血漿和全血中LTG含量無差異方面存在漏洞，但提示在臨床血漿樣本量不足的情況下可以取全血進行LTG含量測定，也提示血漿樣本存在溶血現象時不影響LTG含量測定。

本研究建立LTG血漿濃度檢測法不受卡馬西平、奧卡西平、苯妥英鈉、丙戊酸鈉、托吡酯、地西泮、氯硝西泮、三唑侖、艾司唑侖、咪達唑侖等常見抗癲癇藥物的干擾。本研究LTG血漿濃度HPLC測定方法應用于臨床血藥濃度檢測，與多篇關于拉莫三嗪血藥濃度與療效關系的報道所提出的參考血藥濃度范圍相一致［4-8］。