加熱法破壞IgM在孕婦免疫血清學檢測中的應用

樓菊蓉

【摘 要】目的：探討不同方法破壞IgM，檢測孕婦IgG抗A（B）抗體效價的效果。方法：隨機檢測7例門診O型Rh陽性孕婦，對每一例孕婦血清分成三份，分別采用63℃10分鐘、63℃20分鐘及DTT破壞血清IgM后，比較IgG抗A（B）效價的差異，并探討63℃10分鐘、63℃20分鐘及DTT法的相關性。結果：水浴法不僅中和IgM抗體，。63℃20分鐘與DTT法比較IgG抗A（B）效價結果存在顯著差別（P<0. 05），63℃10分鐘與DTT法比較IgG抗A（B）效價結果無顯著差別（P>0. 05）。三種方法分離IgG結果有高度正相關。結論：63℃加熱10分鐘操作簡單，影響因素少，沒有致癌性，對身體影響小，試驗時間也較DTT短，是值得運用的技術。

【關鍵詞】孕婦免疫性抗體;水浴加熱法;DTT

【中圖分類號】 R715

【文獻標識碼】 B【文章編號】 1672-3783（2019）04-03-010-01

背景

新生兒溶血病（HDN）是發生在胎兒或新生兒的一種免疫溶血性疾病，是由母嬰血型不合引起。研究證實[12]，母親的IgG可通過胎盤上的Fc受體轉運到胎兒體內。新生兒溶血病的發病幾率依照孕婦IgG抗A或者抗B的抗體效價而變化，效價越高，發病幾率越大，且孕婦抗體效價變化越快越早，新生兒溶血病的發病幾率越大[3]血清中抗A和抗B是IgM和IgG的混合物，要測定IgG抗A和抗B抗體，需要排除IgM的干擾。然而采用二硫蘇糖醇（DTT）方法破壞gM抗體是血型血清學檢查中的常用技術，這種方法所需時間長，很難及時為臨床提供診斷依據，國內有人報道血型血清加入生理鹽水70℃水浴30分鐘破壞gM抗體完全且不影響IgG[4]，外國文獻指出63度10分鐘的溫度能破壞IgM抗體[5]. 為了提高血清學檢查的效率，探討新方法來補充臨床實驗室對檢測孕婦免疫性抗體。運用63℃10分鐘和63℃20分鐘水浴法對7例標本對比中和IgM的效果，及平行測定IgG抗A（B）效價與DTT測定結果進行比較，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 標本來源

隨機選取7例O型孕婦，Rh （D）陽性，不完全抗體篩選試驗陰性為對象，。

1.2 儀器與試劑

可調節溫度水浴箱、恒溫水浴箱、;3% A型和B型Rh（D）陽性血球（選6～8人份配制）、0.8% 標準A、B型血球（長春博訊生物技術公司，）10mmol/lDTT（BIOSHARP公司）抗人球蛋白（抗IgG+C3d）檢測卡（江蘇力博生物技術公司），LB-3000醫用低速離心機等。

1.3 操作與方法

1.3.1 將7例O型孕婦血清分成2份，一份用兩種方法檢測IgM 抗A（B）效價。①DTT檢測法：取孕婦血清100ul與10mol/LDTT溶液700ul混勻，加蓋37℃孵育30分鐘，0.9%氯化鈉溶液作倍比稀釋，稀釋度分別為1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后加入3%A，B型紅細胞懸液各一滴，直接3000轉15秒離心肉眼觀察試管是否凝集。以出現凝集強度1+的最高稀釋度的倒數為孕婦IgM抗A（B）效價②水浴檢測法：調節水浴箱溫度到63度，做2管標記，1管取100ul血清加入300ul生理鹽水混勻，放63度水浴箱10分鐘。另一管取100ul血清加入300ul生理鹽水混勻，放63度水浴箱20分鐘.后續各管用0.9%氯化鈉溶液倍比稀釋，稀釋度分別為1：8，1：16等。然后加入3%A，B型紅細胞懸液各一滴，直接3000轉15秒離心肉眼觀察試管是否凝集。以出現凝集強度1+的最高稀釋度的倒數為孕婦IgG 抗A（B）效價

1.3.2 另一份用三種方法檢測IgG 抗A（B）效價。①DTT檢測法：取孕婦血清100ul與10mol/LDTT溶液700ul混勻 ，加蓋37℃孵育30分鐘，0.9%氯化鈉溶液作倍比稀釋，稀釋度分別為1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等。然后吸取25μl稀釋處理好的血清，加入中抗人球蛋白（抗IgG+C3d）檢測卡，再加入其標準0.8%A，B紅細胞各1滴，混勻37℃孵育15min，用LB-3000離心機離心9min，結果判讀。②水浴檢測法：調節水浴箱溫度到63度，做2管標記，1管取100ul血清加入300ul生理鹽水混勻，放63度水浴箱10分鐘。另一管取100ul血清加入300ul生理鹽水混勻，放63度水浴箱20分鐘。后續各管用0.9%氯化鈉溶液倍比稀釋，然后吸取25ul稀釋處理好的血清，加入中抗人球蛋白（抗IgG+C3d）檢測卡，再加入其0.8%標準A，B紅細胞，混勻37℃孵育15min，用LB-3000離心機離心9min，結果判讀

1.4 統計學處理 用Graphpad prism6統計軟件，檢測結果以2 為底數取指數后計算結果。P<0.05表示兩組之間有顯著性差異。用pearson檢驗做相關性分析，若P<0.05表示兩組之間有顯著性相關。

2 結果

2.1 三種方法中和IgM抗體結果

DTT法和63℃水浴法對IgM抗體中和效果無明顯差異，63℃10min與63℃20 min破壞IgM抗體同樣較徹底。遂接下來選擇63℃10分鐘和63℃20分鐘水浴法對IgG抗體進行檢測。見表1.

2.2 三種方法取得IgG效價

分別用63℃10min與63℃20min檢測7例0型孕婦IgG效價，對檢測結果DTT30min進行醫學統計，方差齊（P<0.01），用單向方差分析檢驗，63℃10min與DTT30min檢測效果無顯著性差異（P>0.05），63℃20min與DTT30min檢測效果有顯著性差異（P<0.05），63℃10min檢測檢測IgG抗A（B）效價結果同樣也準確。見表2

2.3 兩種水浴法和DTT法相互關系

根據63℃10min分離血清IgGA.IgGB與DTT30min分離血清IgGA.IgGB效價之間，63℃20min分離血清IgGA.IgGB與DTT30min分離血清IgGA.IgGB效價之間，分別存在高度相關性（P <0.01），但圖1中R2=0.9177與1相近，說明63℃10min方法優于63℃20min方法.見表3

3 討論

從實驗結果得出三種方法通過處理稀釋血清可以做到使鹽水凝集程度下降而最后抗體滴度沒有下降，可以知道此凝集是由于IgG型抗體而非IgM型抗體破壞不完全引起，保障了檢測IgG型抗體結果準確。

本實驗利用IgG具有耐熱的物理特性，通過加熱加速分子間的化學反應，快速破壞不耐熱的IgM抗體[6]，致敏紅細胞，縮短溫育時間，可使產前免疫性抗體檢測在10～20min內完成。試驗結果表明，水浴法優于化學法，實驗時間短，同時IgM抗體活性破壞完全。水浴法成功破壞了血清中的IgM抗體，保證了IgG抗體性質不變，使IgG抗體測定準確無誤。通過本實驗顯示，運用63℃10min與DTT30min處理血清后，測定IgG抗A（B）效價，結果無統計學差異（P>0.05）。

通過實驗顯示兩種水浴法與DTT法有高度正相關性，63℃10min方法優于63℃20min（R2=0.9177）。DTT還有化學致癌性[7]，實驗操作時間長， DTT對IgM抗體中和能力較差[7]。63℃加熱10分鐘操作簡單，易控制，影響因素少，沒有致癌性，對身體影響小，試驗時間也較DTT短，是值得運用的技術。

參考文獻

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[2]Tamm A，Kister A，N01te KU，et a1.The IgGbindingsite of human Fc gamma RⅢB receptor involves CCand FG loops of the membrane—proximal domain.J BiolChem.1 996，271（7）：3659—3666.

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