蒙醫不同針刺法對抑郁大鼠前額葉單胺類神經遞質及PKA/CREB/BDNF通路的影響

艾麗雅 楊利娟 劉俊彤 敖其爾 賽音朝克圖

[摘要] 目的 觀察蒙醫不同針刺法對抑郁大鼠前額葉神經遞質及蛋白激酶（PKA）活性、環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）磷酸化和腦源性神經營養因子（BDNF）表達，探究蒙醫不同針法的抗抑郁作用機制。 方法 將40只雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機數字表法分為空白組、模型組、蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組和藥物組，每組8只。除空白組外其他組大鼠孤養并給予不可預知的7種不同的應激刺激28 d。其中空白組每籠飼養4只，正常飲水攝食，不給任何刺激;模型組不給予任何治療;蒙醫銀針組于每日接受應激刺激前1 h，進行蒙醫銀針刺激巴達干穴、心穴和黑白際穴;蒙醫三根平衡針組的針刺和選穴同蒙醫銀針組，但每日選取1個穴位給予溫針刺激;藥物組于每日進行應激刺激前1 h，將鹽酸氟西汀以0.9%氯化鈉溶液配制成1 mg/mL，按照2 mg/kg體重，灌胃給藥。28 d后斷頭，取大鼠前額葉，采用酶聯免疫吸附法和Western blot法檢測5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，PKA活性，CREB磷酸化和BDNF表達水平。 結果 與空白組比較，造模28 d后模型組大鼠前額葉5-HT、NE、DA含量顯著降低（P < 0.01），PKA活性、CREB和BDNF表達水平也明顯下降（P < 0.05）。與模型組比較，蒙醫三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉NE、DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05），蒙醫銀針組大鼠前額葉DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與模型組比較，蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組和藥物組大鼠前額PKA活性、CREB和BDNF表達水平顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 蒙醫不同針法能有效提高5-HT、NE、DA含量、PKA活性及CREB-BDNF的表達，提示蒙醫不同針法均有抗抑郁作用。

[關鍵詞] 蒙醫;針刺;抑郁癥;單胺類神經遞質;PKA/CREB/BDNF通路

[中圖分類號] R749.4;R245? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0009-05

抑郁癥是以持續的情緒低落為主要特征的精神障礙。目前對于抑郁癥的發病機制尚不完全明了。很多研究數據顯示，單胺類神經遞質在腦內的含量水平與抑郁癥的發病密切相關[1-2]。腦源性神經營養因子（BDNF）參與促進神經元發育、分化、再生等一系列生物學效應[3]。在抑郁動物模型中，大腦海馬和前額葉皮質內環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）和BDNF表達異常[4]。而且抑郁癥患者BDNF水平與漢密爾頓抑郁量表（HAMD）得分呈負相關[5]。BDNF能促進5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）能神經元的再生和發芽，促進前額葉、海馬神經元的生成[6]。因此，本研究觀察蒙醫不同針刺法對抑郁模型大鼠前額葉蛋白激酶A（PKA）活性、CREB磷酸化、BDNF表達及5-HT、去甲腎上腺素（NE）、DA含量的影響，探究蒙醫不同針法的抗抑郁作用機制，同時可進一步闡釋PKA/CREB/BDNF信號通路在抑郁癥發病機制中的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠40只，1.5～2.0月齡，體重（220±10）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SYXX（京）2012-0001，于北京中醫藥大學實驗動物中心飼養，所有實驗均在屏障系統下進行。大鼠可自由進水和進食以適應環境，飼養7 d，而后測量體重，同時采用開野試驗、糖水試驗等進行行為學檢測，通過開野試驗剔除過于活躍和安靜的大鼠，留下適合條件的40只大鼠，并將其按照隨機數字表法分為五組（空白組、模型組、蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組和藥物組），每組8只。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器? 電泳儀（美國Bio-Rad公司）;水平脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）;ABI7500熒光定量PCR（Applied Biosystems公司）;蒙醫RZ-Ⅰ型電熱銀針治療儀（內蒙古元陽中蒙醫科技開發有限公司）;溫冷凍離心機及MultiSkan3酶標儀均購于美國Thermo公司。

1.2.2 試劑? 鹽酸氟西汀膠囊（百憂解，20 mg×28粒，禮來蘇州制藥有限公司）;5-HT（美國Sigma公司，批號：114K7028）;DA、NE（中國食品藥品檢定研究院，批號：100070-201006、100169-21103）;CREB抗體（美國CST公司）;BDNF抗體（美國Santa公司）;山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（北京天德悅公司）;β-actin鼠單抗（美國Immunoway公司）。

1.3 造模與干預方法

1.3.1 造模方法? 依照文獻[7-8]，造模大鼠全部孤養，并且在28 d內隨機進行4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾3 min、水平搖晃30 min、潮濕環境24 h等7種不同應激刺激。每天進行1種刺激，但同一種刺激不可連續重復出現，每種刺激最少可進行3次。經過28 d造模后通過行為學（開野試驗、糖水試驗）及體重檢測證明慢性應激抑郁模型大鼠造模成功。

1.3.2 干預方法? 空白組大鼠合籠飼養，其他各組大鼠均孤養。空白組：正常飲水攝食，不給予任何刺激。模型組：接受7種不同的應激刺激。蒙醫銀針組：每天接受應激刺激前1 h，進行蒙醫銀針（銀針長度3 cm、直徑0.65 mm）刺激巴達干穴、心穴、黑白際穴。每次留針時間為20 min，并且針刺時巴達干穴、心穴針尖向上斜刺0.8 cm，黑白際穴針尖向下斜刺0.8 cm。蒙醫三根平衡針組：針刺和選穴同蒙醫銀針組，但每日取1個穴位，并且針柄連接蒙醫RZ-Ⅰ型電熱銀針治療儀加溫刺激（溫度40～42℃），每次加溫20 min。以第1天巴達干穴、第2天心穴、第3天黑白際穴為加溫循序依次循環刺激。藥物組：在每天接受應激刺激前1 h，把鹽酸氟西汀（百憂解）以0.9%氯化鈉溶液配制成1 mg/mL，按2 mg/kg體重灌胃給藥。每組干預方法都進行28 d。注：巴達干穴位于第三胸椎下凹正中，心穴位于第7胸椎下凹正中，黑白際穴位于前正中線，兩乳正中的心窩處。

1.4 觀察指標

行為學檢測全部完成后對大鼠進行開胸腔，暴露心臟，先用0.9%氯化鈉溶液灌流10 min，而后用4%甲醛急灌10 min，慢灌20 min。斷頭取腦，除去顱骨，在冰袋上迅速取出海馬，取下額葉，稱重，放置速凍管，液氮速凍，并保存于-80℃超低溫冰箱待測。上述操作均在冰盤上3 min內完成。利用酶聯免疫吸附法按照試劑盒操作說明測試前額葉5-HT、DA、NE表達水平，利用Western blot法檢測PKA活性、CREB和BDNF表達水平。用BCA法提取組織蛋白，以β-actin（分子量為42 kD）作為內參照，用Total Lab Quant軟件圖像分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，所有檢測數據以均數±標準差（x±s）表示。若各組數據服從正態分布，且數據方差齊，則采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;若數據非正態分布或方差不齊，可采用非參數檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蒙醫不同針法對抑郁大鼠前額葉皮質5-HT、DA、NE含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠前額葉NE、DA和5-HT含量顯著降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉NE、DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）;與模型組比較，蒙醫銀針組大鼠前額葉DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠前額葉PKA活性、CREB和BDNF表達水平比較

2.2.1 蒙醫不同針法對抑郁大鼠前額葉PKA活性的影響? Western blot結果顯示，與空白組比較，模型大鼠前額葉PKA活性明顯降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉PKA活性顯著升高（P < 0.05）。

2.2.2 蒙醫不同針法對大鼠前額葉CREB和BDNF表達的影響? Western blot檢測顯示，與空白組比較，模型組大鼠前額葉CREB和BDNF表達降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉CREB和BDNF表達上升（P < 0.05）。

3 討論

慢性不可預知應激模型是抗抑郁藥物評價應用最廣泛的模型。在前期研究工作中發現，給予慢性應激刺激后模型組大鼠活動減少，探索興趣降低[9]，證明造模成功。

單胺類神經遞質失衡假說在抑郁癥治療和發病機制研究中起重要作用[10]。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠額葉5-HT、NE、DA含量明顯降低（P < 0.01），蒙醫不同針刺法均能提高抑郁大鼠額葉5-HT、NE、DA含量。證實了腦內神經遞質轉運失衡與抑郁發生密切相關的假說。多項研究顯示，CREB-BDNF通路廣泛參與抑郁癥的發生。CREB是一種轉錄因子，其在蛋白家族激活后主要的功能是調節基因轉錄[11-12]。cAMP通過PKA使其下游靶標CREB的Ser133點位發生磷酸化[13]，磷酸化的CREB與細胞核內的環磷酸腺苷反應元件結合因子特異性結合后誘導相應的基因表達[14]。BDNF是CREB的經典下游靶基因[15]，cAMP通過激活PKA，使CREB磷酸化，從而促進BDNF基因表達[16-17]。抑郁癥患者海馬、前額葉和血清BDNF含量明顯下降，給予抗抑郁藥物治療能夠增加BDNF的表達[18-19]。

本研究結果顯示，給予慢性應激刺激28 d后PKA活性及CREB和BDNF表達明顯下降。蒙醫銀針組、蒙醫三根平衡針組和藥物組的PKA活性及CREB和BDNF表達水平均高于模型組。提示慢性應激抑制PKA活性及CREB和BDNF的表達，抗抑郁治療能夠改善PKA活性以及CREB和BDNF的表達。提示蒙醫不同的抗抑郁針刺法均對PKA的激活、CREB和BDNF基因表達具有明顯的促進作用。

研究表明，5-HT神經傳遞和BDNF水平都可以增加抑郁易感性[20]。BDNF能促使5-HT神經元的存活以及分化，5-HT轉運也可刺激BDNF的表達[21]。但是由于促進5-HT/NE/DA膜轉運途徑的相關調控分子比較復雜，而且抑郁的發生依賴于基因、心理、環境等多種復雜因素的交互作用，而不是單一、簡單清晰的發病機制，BDNF以外的其他基因也有可能參與調節5-HT系統的失衡。故5-HT/NE/DA系統和BDNF信號通路對抑郁癥的調節作用和生理功能所產生的影響仍待進一步研究。

[參考文獻]

[1]? Goda R，Otsuka T，Iwamoto A，et al. Serotonin levels in the dorsal raphe nuclei of both chipmunks and mice are enhanced by long photoperiod，but brain dopamine level response to photoperiod is species-specific [J]. Neurosci Lett，2015，593：95-100.

[2]? Huang SJ，Zhang XH，Wang YY，et al. Effects of Kaixin Jieyu Decoction on behavior，monoamine neurotransmitter levels，and serotonin receptor subtype expression in the brain of a rat depression model [J]. Chin J Integr Med，2014，20（4）：280-285.

[3]? Park H，Poo MM. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function [J]. Nat Rev Neurosci，2013，14（1）：7-23.

[4]? 李昆，孫國平，盧豪忠，等.曲古抑菌素A對抑郁模型大鼠行為及腦源性神經營養因子表達的作用研究[J].中國醫藥導報，2017，14（24）：25-29.

[5]? Shinizu E，Hashimoto K，Okamura N，et al. Alterations of serum levels of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）in depressed patients with or without antidepressants [J]. Biol Psychiatry，2003，54（1）：70-75.

[6]? 鄧海峰，孫縵利，吳瓊，等.毛蕊花糖苷通過調控BDNF-TrkB信號通路改善CUMS大鼠的抑郁樣行為[J].中國病理生理雜志，2018，34（9）：1633-1637.

[7]? Katz RJ，Baldrighi G. A further parametric study of imi-pramine in an animal model of depression [J]. Phamacol Bichem Behav，1982，16（6）：969-972.

[8]? 許晶，李曉秋.慢性應激抑郁模型的建立及其評價[J].中國行為醫學科學，2003，12（1）：14-17.

[9]? 賽音朝克圖，白淑英，景泉凱，等.蒙醫三根平衡針對慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經元形態及BDNF-CREB信號通路的影響[J].中華中醫藥雜志，2017，32（8）：3667-3670.

[10]? Ruda-Kucerova J，Amchova P，Havlickova T，et al. Re- ward related neurotransmitter changes in a model of depression：an in vivo microdialysis study [J]. World J Biol Psychiatry，2015，16（7）：521-535.

[11]? Imbe H，Kimura A. Repeated forced swim stress affects the expression of pCREB and △FosB and the acetylation of histone H3 in the rostral ventromedial medulla and locus coeruleus [J]. Brain Res Bull，2016，127：11-22.

[12]? Kudo T， Uda S，Tsuchiya T，et al. Laguerre Filter Analysis with Partial Least Square Regression Reveals a Priming Effect of ERK and CREB on c-FOS Induction [J]. PLoS One，2016，11（8）：e0160548.

[13]? Thome J，Sakai N，Shin K，et al. cAMP response element-mediated gene transcription is upregulated by chronic antidepressant treatment [J]. J Neurosci，2000，20（11）：4030-4036.

[14]? Sharma N，Lopez DI，Nyborg JK. DNA binding and phosphorylation induce conformational alterations in the kinase-inducible domain of CREB. Implications for the mechanism of transcription function [J]. J Biol Chem，2007， 282（27）：19872-19883.

[15]? Marzieh Rezai，Mehdi Mahmoodi，Ayat Kaeidi，et al. Effect of crocin carotenoid on BDNF and CREB gene expression in brain ventral tegmental area of morphine treated rats [J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biome-dicine，2018，8（8）：387-393.

[16]? Mlyniec K，Budziszewska B，Holst BA，et al. GPR39（Zinc receptor）knockout mice exhibit Depression-Like behavior and CREB/BDNF Down-Regulation in the hippocampus [J]. Int J Neuropsychopharmacol，2015，18（3）：1-8.

[17]? Razavi BM，Sadeghi M，Abnous K，et al. Study of the Role of CREB，BDNF，and VGF Neuropeptide in Long Term Antidepressant Activity of Crocin in the Rat Cerebellum [J]. Iran J Pharm Res，2017，16（4）：1452-1462.

[18]? Kim Y，Lee HY，Cho SH. Antidepressant Effects of Pharmacopuncture on Behavior and Brain-Derived Neurotrophic Factor（BDNF）Expression in Chronic Stress Model of Mice [J]. J Acupunct Meridian Stud，2017，10（6）：402-408.

[19]? Taliaz D，Stall N，Dar DE，et al. Knockdown of brain-derived neurotrophic factor in specific brain sites precipitates behaviors associated with depression and reduces neurogenesis [J]. Mol Psychiatry，2009，15（1）：80-92.

[20]? Aznar S，Klein AB，Santini MA，et al. Aging and Depression Vulnerability Interaction Results in Decreased Serotonin Innervation Associated With Reduced BDNF Levels in Hippocampus of Rats Bred for Learned Helplessness [J]. Synapse，2010，64（7）：561-565.

[21]? Mattson MP，Maudsley S，Martin B. BDNF and 5-HT：a dynamic duo in age-related neuronal plasticity and neurodegenerative disorders [J]. Trends Neurosci，2004，27（10）：589-594.

（收稿日期：2018-08-15? 本文編輯：張瑜杰）