芝麻香型白酒對小鼠飲酒行為情緒及多巴胺神經遞質水平的影響

趙德義 ，皇甫潔 ，曹建全 ，孫 偉 ，韓興林 ，王德良

（1.山東景芝酒業股份有限公司，山東濰坊262119； 2.中國食品發酵工業研究院，北京100015；3.科技部國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京100015）

我國白酒釀造具有悠久歷史，在工藝上與西方蒸餾酒釀造存在顯著不同。我國白酒由于采用多維微生物發酵等傳統釀造工藝，酒體和諧豐滿，風格獨特。與世界上其他蒸餾酒相比，中國白酒是微量風味組分和生物活性成分最為豐富的蒸餾酒。同時，中國白酒香型眾多，不同工藝生產的白酒，微量風味組分的含量及比例差異顯著。目前國內在研究白酒健康課題時側重于白酒中單體微量成分，如核苷、四甲基吡嗪、萜烯類等成分。但由于這些成分在酒體中含量較低、研究結果不能準確描述和定量出在以大量酒精為載體溶劑的條件下，這些成分在人體生理代謝中明確的作用。消費者在飲用不同香型或工藝白酒時，普遍反映不同工藝白酒在人體中的積累和代謝速度顯著不同，分析認為這可能與其微量成分相關，微量成分比例及種類顯著影響酒精在人體內生理代謝的程度。因此，認為不同工藝釀造的白酒，由于其酒體成分含量及比例的差異性，消費者飲酒后的行為情緒感受也有一定差異性。有些白酒造成的不適感相對較少，放松愉悅感相對較明顯，有些造成的不適感相對較明顯，放松愉悅感相對較小。

消費者飲酒后有不同的感受，包括喜悅、高興、緊張、舒緩放松、壓抑等等。從生物化學角度來說，這些感受是由神經和分子變化機制所調控的。飲酒后體內的酒精及酒體中其他微量成分直接保留或間接轉化的小分子代謝物作用于神經元細胞上的受體蛋白，調控其翻譯過程，進而增強樹突鈣離子信號發揮調控作用。飲酒后心情愉悅，自信和健談，鎮靜舒緩都與酒和某些酒體成分進入大腦后對獎賞中心的信號激活有關。多年研究已經證明[1，3]，能夠參與信號激活的體內小分子代謝物質包括乙醇、乙醛、乙酸、多巴胺、5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸、γ-氨基丁酸、腎上腺素等。其中，乙醇、乙醛、乙酸與酒體代謝轉化快慢有關，5-羥色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺、腎上腺素是神經遞質，通過改變其表達水平，影響大腦中的其他化學分子表達，作為化學信使向全身傳遞信號，控制人的思維過程、行為和情緒。

本實驗選定了芝麻香型白酒一品景芝芝香白酒與其他類型的白酒，通過比較分析小鼠灌胃不同白酒30 min和2 h后在固定時間運動的行為參數比，以及小鼠大腦皮層、海馬中多巴胺表達水平，基于此從行為整體和分子層面評價以一品景芝芝香白酒為代表的芝麻香型白酒飲用后帶來的飲后行為情緒差異。

1 材料與方法

1.1 材料

酒樣：來自山東景芝酒業股份有限公司提供的及市售的幾款不同品牌芝麻香型及其他類型白酒，分別是：一品景芝芝香白酒（53%vol），一品景芝芝香白酒（42%vol），某芝麻香型酒A（53%vol）、某芝麻香型酒B（42%vol），某醬香型代表酒（53%vol）、某濃香型代表酒（52%vol），伏特加（96%vol）作為食用酒精對照。

實驗動物：C57小鼠，雄性，清潔Ⅱ級，4～6周齡，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。隨機選取小鼠80只，平均體重為23 g±2 g，于室溫23℃±2℃，光照（150 lx）12 h和黑暗12 h環境，自由飲水進食飼喂，1周后進行實驗。實驗前提前1天將小鼠置于曠場實驗室以適應環境。

1.2 儀器與設備

曠場實驗動物行為學跟蹤系統：ANY-Maze系統（美國Stoelting公司），該儀器主要由一個半徑為20 cm的白底箱壁透明半封閉有機玻璃圓筒組成，其頂部中央懸掛有攝像機，并與記錄系統相連，以此來跟蹤小鼠在曠場中的行為，其數據由ANYMaze軟件進行記錄并分析。

柏恩特超純水制備儀。Multiskan FC酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠灌胃

實驗時，將小鼠隨機分為實驗組和對照組1（96%vol食用酒精）和對照組2（生理鹽水），每組10只。根據《中國居民膳食指南（2016）》規定：成人飲酒，男性酒精量≤25 g/d，女性≤15 g/d。因此，每只小鼠灌酒酒量按照人體標準飲酒量并依據小鼠單位體重與人體單位體重的藥劑等效劑量比值（9.1倍）進行折算。每只小鼠（平均體重20.3 g）灌酒樣酒量（將所有酒樣統一用蒸餾水稀釋至42%vol）為0.15 mL/只；相當于成年男性（平均70 kg）攝入酒精量20.04 g/人。

1.3.2 曠場實驗

在灌胃完成后，計錄時間。在灌酒后30 min和120 min后，依次按照分組將每只小鼠放置于曠場底面中央。利用高頻攝像機及軟件跟蹤記錄動物在曠場內自由運動60 s內的行為變化，采集的數據主要為移動距離。實驗過程中保持安靜，動作輕柔；每只動物實驗結束后，及時清除糞便，使用72%乙醇溶液清潔底面并擦干，減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.3.3 小鼠腦組織樣本多巴胺（DA）濃度測定

給小鼠灌胃酒后，分別在30 min和2 h后直接處死小鼠，取材腦組織（大腦皮層、海馬體等），液氮保藏后，放于-20℃保存，但應避免反復凍融。將組織標本切割，稱取重量，加入一定量的PBS（pH7.4）。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2～8℃的溫度。加入一定量的PBS（pH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20 min左右（2000～3000 r/min）。仔細收集上清液。分裝后取一份待檢，其余冷凍備用。小鼠腦區多巴胺分析采用上海mibio酶聯生物公司的小鼠多巴胺（DA）酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒。

1.4 實驗數據統計分析

本實驗結果采用SPSS Statistics 24軟件，使用單因素ANOVA方法進行統計，并使用Tableau作圖，數據使用均數±標準誤差表示；同時，使用數值變量對應分析方法和因子分析方法進行分析。

2 結果與討論

2.1 飲酒后小鼠曠場行為參數差異分析

動物精細行為學是試驗動物在精確控制前提下模型解析人在外界環境及刺激下的行為及產生原因的試驗系統。在很多場景下不但能模擬人情緒、運動、活動等各方面特點，而且實驗結果具有較高的重復性，是目前國際上通行的試驗方法。在神經精神藥物的評價方面，利用動物行為學方法在神經生物學新機制的發現、神經系統疾病新動物模型的建立、神經系統疾病發病新機制的發現、藥物或環境化合物新神經毒性作用及發生新機制的發現等領域得到廣泛認可。

本實驗將灌胃不同酒樣的每組小鼠依次在灌酒前（t0），灌酒后 30 min（t1）和灌酒后 120 min（t2）這3個時刻置于動物精細行為學分析裝置曠場中（直徑100 cm的白底透明壁的圓柱形設備）中，采用高頻攝像機和行為學分析軟件分別實時錄制與同步分析小鼠在上述3個時刻小鼠自由運動1 min的行為軌跡；通過行為參數自動分析，根據獲得的灌酒前和灌酒后的行為學參數，通過灌酒后行為參數（t1，t2）灌酒前行為參數（t0），分析計算得到行為參數比，用于評價和判定小鼠行為受到酒樣代謝影響后表現程度，通過分析參數比剔除了組內小鼠生物個體差異影響的偏差。結果見表1。

表1 灌酒后(t1：30 min,t2：120 min)每組小鼠行為參數比(移動距離比)

表1表明：不同白酒的工藝類型、風味微量成分的相互整體作用對酒的飲后行為差異有一定影響。以移動時間比進行說明，在適量飲酒范圍內，飲酒后半小時，即使所有的實驗酒樣都稀釋至相同酒精度，但是高酒精度的酒（53%vol）小鼠行為表現興奮，移動距離比大于1，低酒精度的酒（42%vol）行為表現抑制，移動距離比小于1。這可能與酒體中微量成分的作用有關，高度酒微量成分種類豐富，比例協調，香氣口感豐富。在稀釋成42%vol后，其微量成分種類和比例雖然也有相應程度上的稀釋，但是仍對酒體的整體風格有一定程度影響。53%vol一品景芝芝香白酒與某醬香型代表酒和某濃香型代表酒相比，差異不顯著。這兩種對照酒樣無論是從口味、飲用舒適度和品牌上，長期以來都得到消費者廣泛的認可。

根據多年來市場調研數據，多數飲酒環境一般為商業應酬和親朋聚會，消費者關注的飲酒感受重點在飲酒后30 min內和2 h后，希望飲用后30 min內個人的行為情緒最好能不受酒精的影響，或是感覺適量興奮或適量放松，有愉悅的感覺，而在飲酒后2 h能夠快速恢復到正常，不影響隨后的工作和生活。基于前期大量數據積累分析，我們把小鼠酒后行為參數比值范圍及人飲酒后感受特征范圍進行對比（見表2）。當小鼠飲酒后與飲酒前的比值暨行為參數比值為1，小鼠飲酒后行為恢復正常，對應人飲酒表現為與飲酒前感受相同。當行為參數比值范圍區間為1～1.5時，小鼠表現適量興奮，對應人飲酒表現為精神振奮、愉悅高興、有活力壯膽；當行為參數比值范圍區間為0.5～1時，小鼠表現為適量抑制，對應人飲酒表現為放松舒緩；當行為參數比值范圍區間為1.6～2時，小鼠行為表現為過度興奮，對應人飲酒表現為亢奮、反應過度、行為不受控制；當行為參數比值范圍區間為0.2～0.5時，小鼠行為表現為過度抑制，對應人飲酒表現為麻痹，幾乎沒有反應，行為不受控制；當行為參數比值范圍區間為＞2或＜0.2時，小鼠行為表現為失去意識，對應人飲酒表現為失去意識。結果分析表明，53%vol一品景芝芝香白酒飲后30 min，小鼠行為參數比范圍在1～1.5之間，表現為適量興奮，對應的人的感受是精神振奮、愉悅高興。42%vol一品景芝芝香白酒飲后30 min，小鼠行為參數比范圍在0.5～1之間，表現為適量抑制，對應的人的感受是放松、舒緩。飲酒后2 h，53%vol一品景芝芝香和42%vol一品景芝芝香，小鼠行為參數比范圍在0.5～1之間，表現為適量抑制，對應的人的感受是放松、舒緩。

若飲酒后和飲酒前行為參數比為1，我們認為酒對行為情緒的影響幾乎沒有，小鼠行為酒后恢復正常，與飲酒前感受相同，我們把此時酒體行為感受定為標準。為充分比較酒樣對行為情緒影響的差異，我們提出了“行為偏離度”這一概念，指飲酒后的行為參數比與1的差值的絕對值。行為偏離度越大，酒樣影響效果越大。飲酒后30 min，相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，與一品景芝芝香白酒相比，行為偏離度較大，分別表現為小鼠行為過度興奮亢奮，對應人的感受是反應過度行為，不受控制以及小鼠行為表現過度抑制麻痹，對應人感受幾乎沒有反應行為不控制。飲酒后120 min，雖然小鼠行為表現處于適量興奮或適量抑制范圍，但是相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，與一品景芝芝香白酒相比，行為偏離度仍然較大，飲后行為不易恢復。與某醬香型代表酒和某濃香型代表酒相比，行為偏離度差異不顯著。

根據以上結果推斷，一品景芝芝香白酒酒體中微量成分整體作用會對酒精代謝和飲酒后行為情緒產生一定影響，一品景芝芝香白酒飲用后更易有適量興奮及適量放松的愉悅感受，更易恢復正常，且酒精的致醉程度較小。

表2 小鼠灌胃后行為參數比值范圍及人飲酒后感受特征范圍

2.2 飲酒后小鼠腦神經遞質多巴胺（DA）表達水平差異分析

多巴胺（C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2），化學名稱為4-（2-乙胺基）苯-1,2-二醇，簡稱（DA），多巴胺是一種神經傳導物質，由大腦回報和愉悅中心區域分泌，用來幫助細胞傳送脈沖的化學物質，可影響一個人的情緒。2000年，確定多巴胺為腦內信息傳遞者的研究人員Arvid Carlsson獲得了諾貝爾醫學獎[1]。多巴胺是大腦的“獎賞中心”，又稱多巴胺系統，主要負責大腦的情欲、感覺，將興奮及開心的信息傳遞，也與上癮有關。酒精進入大腦后，在腦的獎賞中心和協同、記憶部位的中心特定部位——伏隔核神經元里發揮作用。酒精引發伏隔核釋放出大量的多巴胺，讓人們感覺心情愉快，變得自信和健談，對大腦具有鎮靜作用[2，4]。酒精在大腦中的神經細胞之間通過受體信號傳導激活多巴胺表達[5]。德國埃爾朗根-紐倫堡大學（FAU）的科學家們對13000種食物成分進行了研究，想要找出哪些成分能夠刺激大腦反應中心，使人感覺良好，結果發現大麥麥芽和啤酒中含有的大麥芽堿更刺激了多巴胺D2受體，促進了多巴胺釋放程度，使人對事物的感覺更喜歡或是具有“上癮”的偏好性[7]。美國印第安納大學研究人員發現，啤酒的特殊口味可引發大腦中多巴胺的生成。具有酗酒家族史的人們具有更高的多巴胺指數。這項研究掃描了飲用啤酒和運動飲料佳得樂的49位男性測試者，每位男性測試者每15 min飲用15 mL啤酒，結果表明，飲用啤酒者比飲用佳得樂具有更顯著的多巴胺活躍性，同時，測試者在飲用少量啤酒之后表示更渴望飲用啤酒，但這種效應不會出現于運動飲料，雖然運動飲料的口感更佳。這項研究首次令人信服地證實了啤酒口味可在大腦產生特殊刺激效果[8]。多巴胺表達水平在體內處于一種平衡的狀態，微量增加引發愉悅自信舒緩喜好，含量降低過多引起運動遲緩、睡眠紊亂壓力，含量增加過多引起成癮嗜好[6]。

表3 小鼠大腦海馬體和皮層多巴胺含量

圖1 小鼠大腦海馬體（左）和大腦皮層（右）多巴胺含量

本實驗測定小鼠灌胃后30 min和120 min大腦皮層區和海馬區組織中的多巴胺（DA）表達水平，結果見表3和圖1。結果表明，不同香型白酒、同香型不同工藝白酒灌胃小鼠后，小鼠大腦皮層以及海馬體中多巴胺表達水平差異顯著（P＜0.05），多巴胺表達水平在飲用芝麻香型白酒后表達水平顯著增加（P＜0.05），可能與芝麻香型白酒酒體中微量成分整體作用和酒精積累程度有關，多巴胺如果表達量增加在一定的適量范圍內，可以增加愉悅的情緒感受及對芝麻香型白酒的喜好及認可程度。

3 結論

本實驗從行為整體和分子層面測定了小鼠灌胃以一品景芝芝香白酒為代表的芝麻香型白酒及其他類型白酒飲酒后30 min和120 min的曠場運動1 min內的行為參數，以及在此時間點小鼠大腦皮層和海馬體中多巴胺表達水平，進一步分析芝麻香型白酒飲后行為情緒及對神經遞質水平的影響。研究發現相同類型不同工藝的芝香型白酒，飲后行為情緒表現差異顯著，同時多巴胺在大腦中釋放程度差異顯著，推斷可能與白酒中類型和比例的微量成分協同作用相關。芝麻香型白酒相比其他香型白酒，可以引起愉悅放松感覺的神經遞質多巴胺在一定程度上適量積累表達，推斷可能與酒體中存在的能引起愉悅的風味成分種類及比例相關。