3,5-二硝基水楊酸法測定黃水中總糖的含量

宋嬌嬌，裴 斐，馬 勇，朱 青，趙 祥

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

黃水是濃香型白酒主要的副產物，黃水中含有豐富的酸類、酯類、醇類等呈香呈味物質[1]，同時含有大量的糖和蛋白質等大分子物質，限制了黃水的應用[2]，通常將黃水經預處理后再利用，總糖含量是評價處理效果的標準之一。實驗室常用的總糖檢測方法是滴定法與比色法，滴定法對溶液中的總糖含量、滴定速度、滴定環境等都有要求，且個人操作上的習慣、熟練程度等都會對結果造成較大的影響[3]。黃水顏色一般為亮黃色、深黃色甚至黑色，也會干擾對滴定終點的判定。比色法常用的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法，但前兩種方法用的硫酸腐蝕性較強，會造成一定的安全隱患[4]。3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）是半微量定糖法，該方法操作簡單、便捷，雜質干擾較少，便于批量測定，是一種常用的測糖方法[5]。該方法的原理是在堿性條件下還原糖將3,5-二硝基水楊酸中的硝基還原成氨基，生成橘紅色化合物，在一定的范圍內，還原糖含量與顏色成正比[6]。本試驗采用鹽酸將黃水中的總糖水解成還原糖，利用DNS法在最適波長下進行檢測，利用吸光值與還原糖之間的線性關系計算黃水中總糖含量[7]。本研究考察顯色劑添加量、顯色時間、顯色溫度對檢測結果的影響，采用正交試驗確定黃水總糖水解條件，并進行方法學考察，建立3,5-二硝基水楊酸測定黃水中總糖含量的方法，以期為黃水的預處理等應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃水，取自洋河酒廠濃香車間。

重蒸酚，上海一基實業有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

電熱鼓風干燥箱，上海左樂儀器有限公司；純水機，上海摩勒科學儀器有限公司；水浴鍋，常州市億能實驗儀器廠；UV-6000PC型紫外/可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制

DNS試劑的配制[8]：稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸溶于262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液中。將此溶液與500 mL含182 g酒石酸鉀鈉的熱水混合，再添加5 g重蒸酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解后定容至1000 mL，充分混勻，存于棕色瓶中，避光存放7 d后使用。

1 mg/mL葡萄糖標準溶液：精密稱取已烘干的葡萄糖1 g，加純水定容至1 L，充分搖勻備用。

1.2.2 檢測條件優化[9]

（1）顯色劑添加量對檢測結果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別添加顯色劑0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL，100℃水浴中顯色反應10 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

（2）顯色時間對檢測結果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標準溶液，添加顯色劑5 mL，100℃水浴中分別選擇顯色反應時間1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min、19 min、21 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

（3）顯色溫度對檢測結果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標準溶液，添加顯色劑5 mL，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中顯色反應7 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

1.2.3 標準曲線的繪制

取6支25 mL比色管，分別添加0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL的1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，再添加純水使總體積到1 mL，然后添加5.0 mL的DNS試劑，充分混合后在90℃中水浴7 min，取出后用自來水迅速冷卻，加純水至25 mL充分搖勻后靜置。以不加葡萄糖反應液為對照，在540 nm處測定吸光值，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 黃水水解條件的優化

只有黃水中總糖充分水解，總糖含量檢測結果才準確，影響黃水水解的主要條件有水解時間、鹽酸濃度、鹽酸添加量。本試驗參考液態發酵成熟醪總糖水解方法[10]，選擇水解溫度100℃，以水解時間、鹽酸濃度、鹽酸添加量為變量，以吸光值為指標，采用3因素3水平，按L9（33）正交試驗進行黃水水解條件的優化[11]，正交試驗設計因素水平表見表1。

1.2.5 樣品測定

表1 L9（33）正交試驗因素水平表

取1 mL黃水水解液于25 mL容量瓶中，其他步驟同1.2.4，測定樣品的吸光值，并根據標準曲線計算出黃水總糖含量。

黃水濃度(mg/mL)=樣品濃度×稀釋倍數。

1.2.6 方法學考查

（1）精密度試驗

取同一組黃水按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下連續測定6次吸光值。考查方法的精密度。

（2）重復性試驗

取同一批黃水6份，按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下測定吸光值。考查方法的重復性。

（3）穩定性試驗

按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下測定吸光值，在顯色反應結束90 min內，每隔10 min測定1次。考查方法的穩定性。

（4）回收率試驗

取同一黃水水解液，加入不同質量濃度的葡萄糖標準溶液，參照樣品檢測方法對回收率進行考查。

2 結果與分析

2.1 檢測條件優化

2.1.1 顯色劑添加量對檢測結果的影響（圖1）

圖1 顯色劑添加量對檢測結果的影響

由圖1可知，當顯色劑添加量小于5 mL時，溶液吸光值隨著顯色劑添加量的增加而增大；當顯色劑添加量大于5 mL時，溶液的吸光值基本無變化。考慮到節約資源，顯色劑的最佳添加量為5 mL。

2.1.2 顯色時間對檢測結果的影響（圖2）

由圖2可知，隨著顯色時間的延長，吸光值呈現先增加后下降并趨于穩定的趨勢，顯色時間為7 min時，吸光值為最大值，因此選擇顯色時間7 min。

2.1.3 顯色溫度對檢測結果的影響（圖3）

由圖3可知，顯色溫度對檢測結果影響較大，當顯色溫度達到90℃后，吸光值趨于穩定，因此選擇最佳顯色溫度為90℃。

圖2 顯色時間對檢測結果的影響

圖3 顯色溫度對檢測結果的影響

2.2 葡萄糖標準曲線的繪制（圖4）

圖4 葡萄糖標準曲線

由圖4可知，葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=0.6987x-0.0245，線性相關系數R2=0.9956，表明葡萄糖溶液在0～1.0 mg/mL濃度范圍內與吸光值呈現良好的線性關系。

2.3 黃水水解條件的優化

采用3因素3水平正交試驗設計對黃水總糖水解條件進行優化，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

由表2中的極差分析可知，RA＞RC＞RB，3個因素對黃水水解液吸光值的影響順序依次為：水解時間（A）＞鹽酸添加量（C）＞鹽酸濃度（B）。由表3方差分析結果可知，水解時間對黃水水解液的吸光值影響顯著（P＜0.05），其他因素對結果無顯著性影響（P＞0.05）。根據正交試驗結果與分析，水解最佳條件為A2B3C3，即水解時間30 min，鹽酸濃度12 mol/L，鹽酸添加量15 mL。

表2 正交試驗設計與結果

表3 方差分析

2.4 方法學考查

2.4.1 精密度試驗（表4）

表4 精密度試驗結果

由表4可知，精密度試驗結果相對標準偏差RSD值為0.82%＜2%，說明3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖精密度良好。

2.4.2 重復性試驗（表5）

由表5可知，重復性試驗結果相對標準偏差RSD值為1.62%＜2%，說明3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗（表6）

表5 重復性試驗結果

表6 穩定性試驗結果

由表6可知，黃水總糖在0～90 min內吸光值基本穩定不變，相對標準偏差RSD值為1.62%＜2%，說明采用3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖在90 min內穩定性良好。

2.4.4 回收率試驗（表7）

由表7可知，黃水中添加葡萄糖標液檢測回收率在94.60%～97.60%，RSD值均小于2%，證明該方法對總糖的回收性良好，該方法準確度良好。

3 結論

本研究對3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定黃水中總糖的檢測條件和水解條件進行了優化，并進行了方法學考查，建立了DNS法測定黃水中總糖含量的方法。確定了3,5-二硝基水楊酸法檢測黃水中總糖的檢測條件為：顯色劑添加量5 mL，顯色時間7 min，顯色溫度90℃；黃水總糖水解條件為：水解時間30 min，鹽酸濃度12 mol/L，鹽酸添加量15 mL。該方法的精密度、重復性、穩定性良好（相對標準偏差RSD均小于2%），平均加標回收率94.60%～97.60%，RSD值均小于2%。表明該方法檢測黃水中總糖準確、可靠、重現性好。該方法適用于黃水中總糖檢測，可為黃水應用提供依據，也可為其他總糖的測定提供參考。

表7 回收率試驗結果