發(fā)酵液中正己醇含量的檢測(cè)方法

郭 艷，廖勤儉，王 芳，周韓玲，安明哲，李楊華

(四川宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

正己醇是濃香型白酒中一種微量成分物質(zhì)，俗稱(chēng)“雜醇油”，具有強(qiáng)烈的、特殊的刺激性氣味。窖池中酒醅的發(fā)酵，形成了濃香型白酒與眾不同的成分構(gòu)成和風(fēng)味特征[1]，各種微量成分物質(zhì)對(duì)白酒的風(fēng)格形成和風(fēng)格典型性起著至關(guān)重要的作用[2]。當(dāng)白酒中正己醇含量超出一定范圍時(shí)，白酒會(huì)呈現(xiàn)出一種令人不悅的滋味，對(duì)人體有一定的毒害作用[3]。研究人員有對(duì)雜醇油進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，但是專(zhuān)門(mén)針對(duì)正己醇的研究卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了一種檢測(cè)發(fā)酵液中正己醇的檢測(cè)方法，可以通過(guò)氣相色譜快速檢測(cè)出發(fā)酵液中正己醇的含量，對(duì)探究白酒中正己醇的產(chǎn)生機(jī)理具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：窖泥、黃水，取自某濃香型酒廠(chǎng)。

試劑：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、無(wú)機(jī)鹽、碳酸鈉等。

培養(yǎng)基：細(xì)菌完全培養(yǎng)基。

正己醇標(biāo)準(zhǔn)品的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取色譜級(jí)正己醇，以無(wú)水乙醇配制成100 mL濃度為10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置于4℃冰箱中冷藏，備用。

儀器設(shè)備：美國(guó)Agilent公司6890氣相色譜，F(xiàn)ID檢測(cè)器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液培養(yǎng)方法

配制200 mL細(xì)菌完全培養(yǎng)基于500 mL三角瓶中，稱(chēng)取適量底層窖泥加入其中，將三角瓶置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。待菌液培養(yǎng)成熟后，將種子培養(yǎng)液如此重復(fù)培養(yǎng)3次，即為己醇發(fā)酵液。

圖1 正己醇標(biāo)樣圖譜

1.2.2 色譜條件

色譜柱條件：色譜柱：HP-INNOWax Agilent30×0.25×0.25；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器（氫焰離子化檢測(cè)器）溫度250℃；柱流速：恒流1.0 mL/min；分流模式：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫程序升溫：（HP-INNOWax Agilent）40 ℃（保持7 min），以7 ℃/min升溫至100℃（保持2 min），再以30℃/min升溫至180 ℃（保持1 min）。

1.2.3 樣品前處理

取發(fā)酵液5 mL于20 mL離心管中，加入5 mL萃取劑進(jìn)行萃取，振蕩15 min后再靜置15 min，然后于離心機(jī)中以5000 r/min離心5 min，下層萃取液經(jīng)過(guò)0.2 μm的膜過(guò)濾后，待測(cè)。

1.2.4 萃取劑的選擇

取5支20 mL的離心管，向每支試管中加入5 mL空白培養(yǎng)基和10 μL的10 g/L正己醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入5 mL二氯甲烷、正己烷、甲苯、石油醚，振蕩過(guò)濾后待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)樣的檢測(cè)及樣品萃取劑的確定

取10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇稀釋至200 mg/L進(jìn)行定性檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖見(jiàn)圖1。己醇的出峰時(shí)間在15.845 min左右。

用不同萃取劑萃取后的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。由于二氯甲烷萃取后的正己醇測(cè)定值最高，說(shuō)明二氯甲烷對(duì)正己醇的萃取效果最好，所以選擇二氯甲烷為發(fā)酵液的萃取劑。

表1 不同萃取劑檢測(cè)結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

取10 g/L的正己醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用60%vol乙醇稀釋至20mg/L、60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300 mg/L共6個(gè)梯度制作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(mg/L)為X橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，化合物線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.2511x+0.0448，R2值為0.9999，滿(mǎn)足分析要求。根據(jù)3倍信噪比計(jì)算出化合物的定量檢出限為2.5 mg/L。

圖2 正己醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

用上述試驗(yàn)方法對(duì)同一樣品測(cè)定6次，得到的正己醇發(fā)酵液經(jīng)前處理后的待測(cè)樣品中正己醇含量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，6次平行結(jié)果的相對(duì)偏差(RSD)為0.92%，滿(mǎn)足分析要求。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

取同一三角瓶中的發(fā)酵液4份，其中1份作為空白本底值，另外3份分別加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，把4份處理后的樣品進(jìn)行樣品前處理，再按上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)后進(jìn)行回收率的計(jì)算。表3中數(shù)據(jù)為處理后樣品及加標(biāo)處理后樣品的測(cè)定值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液中正己醇的回收率為97.27%～103.72%，滿(mǎn)足分析要求。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

該方法能快速準(zhǔn)確地分析發(fā)酵液中的正己醇含量。發(fā)酵液樣品只需要簡(jiǎn)單的萃取就能進(jìn)樣分析，R2值、檢測(cè)的精密度、加標(biāo)回收率等各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到分析要求。

該方法還可以檢測(cè)濃香型白酒釀造副產(chǎn)物黃水中的正己醇，對(duì)研究黃水的綜合利用有重要意義。