利用基因編輯技術改良水稻性狀的研究進展與展望

楊 平，陳春蓮，熊運華，黃永萍，姚曉云，尹建華

(江西省農業科學院 水稻研究所,江西 南昌 330200)

基因編輯技術是20世紀80年代發展起來的一項非常重要的分子生物學技術——外源DNA被導入靶細胞后,與靶細胞內染色體上的同源DNA序列發生重組,從而整合到靶基因指定的位點,在靶位點切割或定點突變,導致遺傳特性改變。隨著基因組編輯技術日漸成熟,在作物的功能基因研究、遺傳性狀的改良、新品種培育中將發揮重要作用。在培育作物新品種方面,基因編輯技術與傳統的轉基因技術不一樣。傳統轉基因是將外源DNA轉入受體中,使其表達而獲得優良性狀,從而獲得人類所需要的品種;基因編輯技術只是對內源基因進行定點突變或精準編輯,再編輯后代,通過遺傳分離完全可以得到沒有轉基因元件的突變體。因此與傳統育種方式相比,基因編輯技術具有很大的優勢。雖然傳統育種的回交選育也能達到相同的育種目的,但由于回交培育一個近等基因系不僅時間長、工作量大,并且還會產生負面的連鎖累贅效應。而利用基因編輯技術只是定向編輯靶基因,不僅可以縮短培育周期,而且更能有效地避免連鎖的累贅效應。

1 基因編輯技術

近年來,特異性位點核酸酶(site-specific nuclease, SSNs)的發現與開發促使基因編輯技術在基因功能和品種改良方面取得了很大的進展。特異性位點核酸酶是指在基因組編輯過程中對基因組進行定點切割,引入雙鏈缺口的工具酶[1]。迄今為止,主要有4種SSNs:鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALEN)、成簇規律性間隔回文短重復序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats, CRISPR)/Cas9系統。單堿基編輯器技術是不需要切割DNA形成雙鏈斷裂DSB的,只需經化學反應,讓基因組中的一對堿基替換為另一對堿基,從而達到精準編輯基因的目的[2]。

1.1 鋅指核酸酶

鋅指核酸酶(ZFNs)由鋅指蛋白構成的DNA識別域和FokⅠ構成的切割域組成,兩者的結合使靶位點的DNA產生雙鏈斷裂[3]。因此,細胞可以通過同源重組定向修復(HDR)和非同源末端連接途徑(NHEJ)來修復DNA。這兩種修復機制都會產生移碼突變,從而達到基因突變或編輯的目的。由于FokⅠ內切酶需要二聚化才能發揮活性[4],所以不容易構建,而且構建的成本很高。構建靶向特定位點的ZFN需要對目標基因設計8～10個鋅指結構域,然后將這些鋅指結構域與二聚化核酸內切酶結合[5]。

1.2 轉錄激活樣效應物核酸酶

第二代基因編輯技術轉錄激活樣效應物核酸酶(TALENs)的構成與ZFNs相似,由二聚化的FokI核酸內切酶的切割DNA結構域和TAL效應因子(TALE)的結合DNA結構域組成[6]。TALEN同樣不容易構建,構建成本高,一般只能在基礎研究實驗室構建,TALEN包含核定位信號(NLS)域、中央結構域和核酸內切酶功能結構域。構建TALEN需要在靶序列兩側設計兩個TALEN結合位點,在靶向序列處由二聚化的FokI核酸酶切割，從而產生DNA雙鏈斷裂(DSB),然后通過HDR或NHEJ修復。

1.3 CRISPR/Cas9系統

CRISPR/Cas9系統來源于古細菌及原核生物細菌對外源病毒和DNA的免疫系統。成簇的規律性間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR) 在古細菌或細菌中普遍存在[7]。CRISPR/Cas系統可特異性地識別外源DNA,切割并沉默外源基因的表達。CRISPR /Cas系統由CRISPR序列元件和Cas家族組成，它可分為3種類型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。目前的CRISPR/Cas系統由Ⅱ型系統改造而來,Ⅱ型系統僅需一種Cas9蛋白參與,相對比較簡單,而Ⅰ型和Ⅲ型系統需要較多種的Cas蛋白共同參與,比較復雜。CRISPR區域上游有一段作為啟動子啟動后續CRISPR序列轉錄的系列,被稱為前導序列,在前導系列調控下生成前體crRNA (Pre-CRISPR RNA,pre-crRNA)。然后加工為成熟的crRNA,通過堿基配對,與反式激活的crRNA (trans-acting crRNA, tracrRNA)形成單向導RNA (sgRNA)。Cas9核酸內切酶的類HNH和類RuvC分別切割DNA兩條互補鏈,在sgRNA的引導下特異性地識別靶系列并切割形成雙鏈DNA斷裂,從而完成基因組的定向精準編輯[8]。

1.4 CRISPR/Cpf系統

2015年,美國麻省理工學院Zetsche等[9]發現了同樣來源于CRISPR系統的Cpf1核酸內切酶,包括AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1三種核酸內切酶。相比于CRISPR/Cas9系統, CRISPR/Cpf系統有如下優點:(1)Cpf1只需較短一段crRNA識別靶目標,不需tracrRNA,而且Cpf1更簡單、更小、更容易進入細胞;(2)Cpf1的PAM是靶序列為5′端連續的2個或3個胸腺嘧啶(T),擴大了基因組編輯的范圍,也是對CRISPR基因組編輯技術的一個重要補充;(3)Cpf1切割目標系列產生的是粘性末端,更有利于靶序列的同源重組替換和精準插入;(4) Cpf1既可以切割DNA,又能切割RNA,有助于構建多基因編輯的載體。

1.5 單堿基突變編輯技術

Komor等[10]開發出了只需經過化學反應從而讓基因組的一對堿基發生替換的單堿基編輯器,包括胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)。CBE誘導鳥嘌呤(G)變成腺嘌呤(A),誘導胞嘧啶(C)變成胸腺嘧啶(T); ABE誘導A或T變成G或C。與其它基因編輯技術不同,單堿基突變編輯技術不需要核酸內切酶在特異位點處切割DNA,只需產生雙鏈斷裂就能達到精準編輯的目的。Kai等[11]在水稻中首次就應用了ABE編輯器。

2 基因編輯技術在水稻性狀改良中的應用

基因編輯技術除了應用于研究水稻新功能基因組外,最近幾年,應用CRISPR/Cas9系統等基因編輯技術在水稻遺傳性狀(產量、品質、育性、抗性等性狀)改良、新品種培育方面也取得了較大進展(表1)。

2.1 產量和品質相關性狀

產量和品質是典型的數量性狀,水稻的產量主要由有效穗數、每穗粒數和千粒重決定。利用基因編輯技術已經成功改良產量性狀的負調控基因包括GS3、DEP1、GS5、GW2、Gn1a和TGW6[12]。Li等[13]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統編輯Gn1a(OsCKX2)、DEP1、GS3和IPA1，獲得的突變體表型與以前報道的一樣,單株產量得到了提高。Butt等[14]利用CRISPR/Cas9系統定向編輯CCD7基因,獲得了多分蘗突變體。Xu等[15]利用CRISPR/Cas9系統同時突變3個粒重相關基因GW2、GW5和TGW6,獲得了千粒重比野生型增加29.3%的突變體。Li等[16]利用CRISPR/Cas9介導的多基因載體同時組編輯3個負調控生育期基因Hd2、Hd4和Hd5,獲得了早熟的突變體。水稻種子的貯藏特性主要受脂氧合酶(LOXs)的調控,在14個LOX基因家族中有3個基因(LOX1、LOX2和LOX3)在負調控水稻種子的貯藏性。Ma等[17]應用TALENs定向突變LOX3基因，提高了水稻種子的耐貯藏能力。Shan等[18]和Shao等[19]分別利用TALENs和CRISPR/Cas9技術對水稻的香氣基因OsBADH2進行編輯,獲得了香米突變體。Miao等[20]利用CRISPR/Cas9技術編輯調控水稻營養基因PYL家族,獲得了生長力和產量增加的突變體。Ma等[21]利用CRISPR/Cas9系統敲除控制直鏈淀粉含量的基因OsWaxy,獲得了秈稻和粳稻的糯性品系。

表1 基因組編輯技術在水稻遺傳改良中的應用

2.2 育性相關性狀

水稻雜種優勢利用法包括三系法和兩系法,其中環境敏感型兩用不育系由細胞核基因PMS3、TMS5調控。Zhou等[22]利用CRISPR/Cas9系統突變TMS5基因,得到了溫敏不育系,可用于兩系雜交稻的培育。Li等[23]利用CRISPR/Cas9系統突變粳稻CSA基因,得到了2個反光敏不育系(9522csa和JY5Bcsa)和1個光溫敏不育系(KY131csa-4)。李三峰等[24]通過編輯品占中的TMS5、Pi21和Xa13基因,創制出多個tms5/pi21/xa13純合突變的水稻新株系；表型鑒定表明，不同突變方式的純合株系在高溫28 ℃下不育,在低溫23 ℃下轉可育；同時,這些純合突變株系對稻瘟病和白葉枯病的抗性顯著增強。

2.3 生物和非生物脅迫相關性狀

近年來,應用基因編輯的方法大大增強了水稻對病蟲害和逆境的抗性。運用TALENs定向敲除OsSWEET14啟動子區的效應蛋白綁定元件(effector-binding element, EBE),解除了效應蛋白與OsSWEET14啟動子的結合,從而使水稻對白葉枯病的抗性得到了提高[25-27]。Cai等[28]運用TALEN技術修飾Os09g29100基因啟動子中的Tal7結合位點,從而增強了水稻對細菌性條斑病的抗性。Wang等[29]利用CRISPR/Cas9系統敲除水稻品種空育131中的1個編碼AP2/ERF類轉錄因子的基因OsERF922(該基因負調控水稻對稻瘟病的抗性),獲得了抗稻瘟病株系。Xu等[30]利用CRISPR/Cas9系統編輯了水稻的除草劑(苯達松)抗性基因BEL,使該基因的功能傷失，從而使水稻對苯達松敏感。Sun等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統定向對水稻ALS基因的密碼子進行替換,并且通過分離獲得了沒有轉基因元件的抗除草劑水稻株系。

2.4 其它性狀

鎘(Cd)含量超標嚴重影響人體健康。Tang等[32]利用CRISPR/Cas9編輯系統對秈稻的金屬轉運蛋白基因OsNramp5進行突變,田間試驗表明,突變秈稻株系谷粒中的Cd濃度低于0.05 mg/kg,而野生型谷粒中的Cd濃度為0.33～2.90 mg/kg。Wang等[33]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在秈粳雜交稻“春優84”中同時敲除PAIR1、REC8、OSD1 和MTL這4個內源基因,獲得了可以發生無融合生殖的Fix (Fixation of hybrids)材料； Fix植株在營養生長階段表現正常,但其育性明顯下降；通過細胞倍性檢測,在其子代中獲得了細胞倍性為二倍體且基因型與親本完全一致的植株,這些F2代植株的表型也與其F1代雜交稻高度相似。由此證明,通過基因編輯技術同時編輯這4個基因,可以將無融合生殖特性引入到雜交稻當中,從而實現雜種優勢的固定。

3 小結與展望

水稻的有利性狀大部分是數量性狀,由多基因調控?；蛘{控性狀的方式分為正調控和負調控。目前的基因組編輯技術主要針對負調控基因,而對于替換及插入目的片段的獲得性突變的效率很低,因此,未來的任意精準編輯水稻基因技術將會促進功能基因組研究與新品種改良。

水稻功能基因的深入研究及重要功能基因的克隆為利用基因編輯技術改良水稻遺傳性狀、獲得優良性狀品種或種質資源提供了遺傳基礎。將來可以通過基因編輯技術在水稻品質、產量、抗性等方面取得新突破。

基因編輯技術是一個新技術,也同樣面臨著前所未有的機遇和安全問題的挑戰。美國認為由細胞自我修復產生的突變體不屬于轉基因農作物,利用基因編輯技術獲得的作物新品種不屬于轉基因產品(GMO)[34]。歐盟則認為非自然產生的基因編輯產品就是GMO,然而通過化學和物理誘變獲得的突變體在他們看來又不是GMO。顯然,基因編輯的突變與化學、物理誘變在本質上是一樣的,只是手段(技術)不一樣。然而最近歐盟也傾向于將基因組編輯作物定義為非GMO[35]。