酒花與啤酒中單萜化合物的研究進展

洪 凱，馬長偉*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室，北京 100083）

萜類化合物是植物次生代謝產物最大的家族之一，在自然界中廣泛分布，目前已知的萜類物質超過5.5萬 種[1]，萜類物質以異戊二烯作為基本單元，因此，也被稱為類異戊二烯化合物。單萜化合物是萜類化合物中的重要組成成分，廣泛存在于高等植物的分泌組織中，目前已知的單萜化合物有1 000多種[2]，多具有較強的香氣，是化妝品工業的重要原料[3]。同時，單萜化合物因為食用安全且對微生物具有較強的抑制作用，故也被作為防腐劑廣泛應用于食品領域。單萜化合物根據化學結構的不同，分為游離態和糖苷結合態；根據碳架的不同，又分為無環單萜、單環單萜和雙環單萜[4]。

用于啤酒釀造的酒花是成熟的雌性酒花，其苞片內表面的下端被一層腺毛覆蓋，稱為蛇麻腺，也稱為分泌腺或盾狀毛，是由角質層圍成的空腔，空腔內包含一組分泌細胞。酒花蛇麻腺中合成并積累3 類主要次生代謝產物：酒花精油、苦味酸和異戊二烯類黃酮。商業酒花受酒花品種、種植環境和栽培模式等因素的影響通常在這些組分的含量上有差異，這決定了它們在啤酒的苦味、香味和口感方面的作用也各不相同。有研究證明，采摘時間對酒花中單萜和其他香氣化合物具有顯著影響，而修枝時間對酒花以及啤酒的香氣影響不大[5-6]。酒花精油是酒花的主要香氣成分，占酒花質量的0.5%～3.0%，酒花精油的組成由酒花基因型決定，其組成差異與苦味酸、異戊二烯類黃酮共同作為區分不同品種酒花的指標。酒花精油中萜類物質含量最豐富，約占90%[7]，在萜類物質中又以單萜類化合物最多。因此，單萜類化合物對酒花及啤酒的香氣具有突出貢獻。

目前，大多數關于單萜類化合物的研究集中在酒花花果上，而在酒花其他組織中發現單萜類化合物的報道較少，酒花毛囊是否是單萜類化合物生物合成和貯存的專用器官目前也還沒有定論。另有研究發現，釀酒酵母體內存在單萜類化合物合成的甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway，MVA），而且有學者完成了多種萜類化合物在釀酒酵母內的表達，利用代謝工程改造釀酒酵母或者其他微生物生產萜類化合物[1-2,8-9]。

1 酒花中單萜化合物的生物合成

植物萜類化合物的生物合成主要有以下兩條途徑：1）位于植物細胞質體中的甲基磷酸赤蘚糖途徑（2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP）；2）位于細胞質中的MVA[10]。

酒花中的單帖化合物主要通過MEP在質體中合成。以糖酵解產物丙酮酸和3-磷酸甘油醛為起點，在1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）的作用下轉化為1-脫氧-木酮糖-5-磷酸，而后1-脫氧-木酮糖-5-磷酸還原異構酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）催化1-脫氧-木酮糖-5-磷酸轉化為2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸。2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸又經2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞苷酰轉移酶（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase，MCT）環化作用生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-赤蘚糖醇，之后在4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶（4-diphosphocytidyl-2-C-metllyl-D-erythritol kinase，CMK）的作用下，生成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖醇-2-磷酸，再經過2-C-甲基赤蘚糖醇-2,4-環二磷酸合成酶催化生成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環二磷酸，進一步在l-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶（1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase，HDS）作用下形成1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯-4-二磷酸，并在4-羥基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸還原酶（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）的作用下催化形成中間體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及其雙鍵異構體二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），最后各1分子的2 個同分異構中間體IPP和DMAPP在香葉基焦磷酸合成酶（geranyl diphosphate synthase，GPPS）的作用下經頭尾縮合生成香葉基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）[11]。GPP是所有單萜化合物生物合成的底物，在單萜合成酶作用下催化合成一系列單萜化合物。

Goese等通過13C標記的高通量組學研究證明，酒花中葎草酮化合物分子結構中的碳原子來自于脫氧木糖[12]；Champagne等在酒花中鑒定出了MEP合成萜類化合物時上游部分全部的酶（圖1），而在MVA中只鑒定出了乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl coenzyme A (CoA)thiolase，AACT）[13]，由此證實了MEP在酒花腺毛的萜類物質合成中起主要作用。Wang Guodong等鑒定了酒花中除MCT和CMK以外所有與質體MEP中的酶對應的表達序列標簽（expressed sequence tag，EST），而沒有發現與MVA中的酶對應的EST[14]。同樣，Nagel等發現了100 個與MEP相關的EST，卻只發現了10 個與MVA相關的EST，并且只在質體中發現了IPP/DMAPP異構酶[15]。

圖1 萜類化合物上游合成路徑[13]Fig. 1 Upstream pathways for terpenoids synthesis[13]

GPPS催化生成作為單萜合成直接底物的GPP，被子植物中的GPPS由兩個亞基組成，因此，GPPS分為異二聚體和同二聚體。GPPS的小亞基在同二聚體中時是無活性的。酒花中GPPS的小亞基作為功能性異二聚體的活性調節劑，促進IPP向生成GPP的方向進行，而抑制其向香葉基GPP（geranyl GPP，GGPP）的轉化[16]。

Gutensohn等[17]在番茄果實中共表達金魚草GPPS小亞基基因和甜羅勒細胞質萜烯合成酶基因，發現與單獨引入萜烯合成酶相比單萜積累增加。該實驗還表明，GPP可以從質體轉移到細胞質中。GPPS的大亞基在以DMAPP和IPP為底物時可以具有GGPP合成酶（GGPP synthase，GGPPS）活性[16]，GPPS的這個大亞基同時接受GPP作為IPP的共同基質，形成法尼基焦磷酸和GGPP。最近的研究結果驗證了在細胞質中過表達GPPS可以形成碳鏈更長的萜類化合物[18]，這也印證了GPPS小亞基位于葉綠體的外部，表明IPP和GPP在細胞質基質和質體之間可以進行有效的轉運。在單萜合成酶基因的研究中，Champagne等鑒定出對應于單萜合成酶的2 個EST，在與全長序列比對后，確定這2 個EST屬于相同的2型單萜合成酶，該酶催化酒花精油中主要單萜β-月桂烯的體外合成[13]。

圖2 異戊烯基類黃酮化合物的合成路徑[19]Fig. 2 Schematic of prenylf l avonoids biosynthetic pathways[19]

目前，越來越多的證據表明，苯丙烷途徑和萜類合成途徑之間存在相互聯系（圖2）。金魚草花中的單萜合成依賴于GPPS和單萜烯合成酶的活性，它們同時也通過尚未表征的上游調節機制影響苯丙烷的產生[20]。最近在番茄腺毛的研究中發現，缺失查耳酮異構酶（合成類黃酮的中心前體柚皮素）會削弱萜類物質的生成[21]。此外，玫瑰花中的轉錄因子PAP1（MYB家族）可能對誘導苯丙烷和萜類化合物通路中揮發性化合物的產生起到共同促進的作用[22]。黃腐酚是酒花中最典型的異戊烯基類黃酮化合物，研究證明，黃腐酚在癌癥發展的各個階段有著良好的抑制效果[23-24]；同時，黃腐酚和8-異戊烯基柚皮素可以通過調節葡萄糖和脂質代謝來改善與2型糖尿病相關的代謝紊亂[25]。Matou?ek等[26]發現，轉錄因子HlWRKY1和AtWRKY75在異戊烯基類黃酮化合物的合成調控中起著重要作用。Ban Zhaonan等[27]鑒定出兩個不具備催化活性的查耳酮異構酶（CHIL1和CHIL2），參與并調控酒花中黃腐酚的生物合成。證明CHIL2能夠與黃腐酚合成通路中上、下游蛋白查耳酮合成酶和膜定位的異戊烯基轉移酶互作并提高它們的活性，形成的代謝復合體可以高效催化黃腐酚的生物合成；而CHIL1能夠結合黃腐酚代謝途徑中柚皮素查耳酮和脫甲基黃腐酚等中間化合物，穩定這些化合物的開環結構，進而維持其生物活性；同時此研究還證明了使用酵母作為工程菌株高效生產黃腐酚的可行性。雌酒花腺毛中異戊烯基類黃酮化合物的含量非常可觀，因此，研究酒花中這兩種途徑之間的關系對于酒花中功能性成分的開發具有重要的指導意義。

2 酒花中單萜化合物的種類

2.1 游離態

酒花精油中的單萜化合物主要由單萜烯和單萜醇類化合物組成[28]。單萜烯易揮發、氧化聚合，在水、麥芽汁和啤酒中的溶解度很低，其中大部分在麥汁煮沸過程中蒸發損失，最終進入啤酒中的單萜烯類化合物非常少[29]。β-月桂烯是重要的單萜化合物，賦予新鮮酒花刺激性氣味[30]，其含量占總酒花精油的30%～60%[31]。酒花精油中其他的單萜化合物含量明顯較低，包括羅勒烯、β-蒎烯、檸檬烯和p-異丙基苯等[32]。酒花中的萜醇類化合物主要包括芳樟醇、香葉醇、橙花叔醇、橙花醇和松油醇，其中芳樟醇含量最豐富，由Chapman于1903年最先鑒定[32]。芳樟醇被認為是啤酒中重要的酒花香味指示化合物。芳樟醇既具有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰花香，又有木香、果香氣息，香氣柔和。芳樟醇對酒花香氣特征的貢獻取決于酒花的添加方式。采用傳統的釀造方法時，酒花在煮沸階段添加，大部分芳樟醇從醪液中揮發損失，對啤酒的香氣貢獻很小；而在發酵階段添加時，發酵液的溫度較低，芳樟醇對啤酒中香氣的貢獻則比較明顯。芳樟醇存在兩種立體異構體：(R)-(-)-芳樟醇和(S)-(+)-芳樟醇。(R)-(-)-芳樟醇閾值較低，風味活性更強，并且在芳樟醇中通常占92%～94%。香葉醇、橙花醇是酒花精油的重要組成部分，香葉醇具有溫和、甜蜜的玫瑰花氣息和苦味感。而橙花醇具有令人愉快的玫瑰花和橙花香氣，香氣平和，微帶檸檬果香。橙花醇是香葉醇的異構體，其香氣比香葉醇柔，并帶有新鮮的清香和柑橘香調。目前，工業合成香葉醇和橙花醇的方法主要是通過β-蒎烯、芳樟醇、檸檬醛等合成[33-35]。近來學者將來自酒花、薄荷和甜羅勒的單萜合成基因編輯進酵母中，通過控制單萜（芳樟醇和香葉醇）合成途徑關鍵基因的表達，代替傳統啤酒釀造中添加酒花的做法，實現了不使用酒花就能達到在啤酒中增加單萜醇的效果，是對啤酒釀造工藝的創新[36]。

單萜醇除賦予啤酒鮮明的香氣外，還具有重要的生物活性。Miyashita等[37]通過活體實驗發現，阿霉素和芳樟醇結合使用能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。Yu等[38]發現香葉醇能夠抑制細胞內甲羥戊酸的生物合成，從而限制蛋白質的異戊烯化，進而對小鼠肝癌和黑色素瘤細胞的生長起到抑制作用。Carnesecchi等[39]發現，香葉醇能抑制70%結腸腫瘤細胞的生長，使細胞內鳥氨酸脫羧酶活力降低50%，抑制細胞內丁二胺的生成。Carnesecchi等[40]的研究還表明，香葉醇造成癌細胞中的胸苷酸合成酶和胸苷激酶表達量減少1 倍。Burke等[41]發現香葉醇還能抑制胰腺腫瘤細胞的生長。

2.2 糖苷結合態

人們對糖苷類風味化合物的研究始于1969年。Francis等首次在玫瑰中證實了糖苷類風味前體物的存在[42]。Williams等的研究發現，在葡萄果實中存在著一些水溶性糖苷結合態化合物，這些化合物在水解后對香氣具有較大貢獻[43]。大量研究表明，植物材料中的風味化合物主要以非揮發性、無氣味、鍵合態糖苷的形式貯存和轉運。

已有研究表明，這些糖苷類化合物也存在于酒花和啤酒中[44-46]。糖苷化合物由糖和糖苷配基兩部分組成，糖的異頭碳結合到糖苷配基的羥基上。糖苷中的糖可以是單糖、二糖或多糖。水解糖苷并釋放糖苷配基的酶，其特異性與糖苷鍵和糖的類型相關。由此產生的酶解產物分為3 類：簡單醇、萜烯醇和羰基化合物[46]。

Kollmannsberger等發現，在酒花及其乙醇樹脂提取物中均能檢測到相當含量的單萜醇，但二氧化碳提取物中卻未檢測到。在啤酒中也能鑒定出相同的糖苷。這些糖苷類化合物雖然總量很低，但從酒花糖苷中釋放的芳樟醇和一些非類胡蘿卜素化合物可能有助于提高啤酒的酒花風味[45]。

3 啤酒釀造過程中單萜化合物的轉化

3.1 游離態單萜化合物的生物轉化

酒花中的單萜化合物最終通過發酵過程進入啤酒中，這些單萜化合物在啤酒中的含量及對應的閾值各不相同，所以對啤酒香氣的貢獻也存在差異。來自酒花精油的單萜醇——芳樟醇在啤酒中始終能被檢測到，且含量顯著高于其風味閾值（R-芳樟醇的風味閾值為2.2 μg/L，S-芳樟醇的風味閾值為180 μg/L），因此，常被用來作為檢測啤酒中酒花香氣強度和質量的參照物[47]。除了芳樟醇，其他的萜烯醇，如香葉醇、香茅醇、松油醇、橙花醇等來源于酒花精油的香氣成分也能從啤酒中檢測到，它們對啤酒的香氣特性也有一定貢獻[48-49]。

芳樟醇被確定為新鮮或干酒花中最有效的風味化合物之一[50]，對啤酒的酒花香味有很大貢獻[51]。其濃度被認為可用于預測啤酒的風味強度。在啤酒釀造的不同階段添加酒花對酒體香氣的貢獻差異較大，傳統釀造工藝中酒花在麥汁煮沸階段加入，在這個過程中芳樟醇的濃度會降低超過95%[48]。采用外加酒花精油或者二氧化碳提取物釀造的啤酒中，這些芳香烴也會很快消散。在外加芳樟醇的啤酒中，其含量在啤酒貯藏期的前2 周快速下降。王露等[52]的研究發現，在煮沸結束、回旋沉淀槽及主發酵結束后添加酒花較煮沸結束前10 min添加能顯著提高萜烯醇及其立體異構體在啤酒中的含量，且在貯藏期間可能存在著一系列的相互轉化。在此期間，啤酒中的萜烯醇如香葉醇、芳樟醇、橙花醇等化合物的濃度在發酵和老化過程中有所增加。發酵前期萜烯醇的變化被認為是酵母代謝的作用，在發酵后期酵母細胞膜的通透性增加，糖苷酶得以分泌到細胞外，此時萜烯醇含量的增加多歸因于糖苷結合態萜烯醇的解離[52-53]。

King等[54]研究了芳樟醇、香葉醇、香茅醇等酒花精油香氣成分在發酵體系中的生物轉化，發現拉格酵母和艾爾酵母均能將香葉醇轉化成香茅醇，將芳樟醇和橙花醇轉化成α-松油醇。拉格酵母還能進一步產生萜烯酯類，如乙酸香葉酯和乙酸香茅酯。Gamero等發現，不同酵母菌種對香葉醇的吸收和轉化比例不同，香葉醇向芳樟醇和α-松油醇的化學轉化緩慢[55]。Brodkorb等[56]發現，卡斯特式菌（Castellaniella defragrans）具備轉化月桂烯、香葉醇和芳樟醇的能力，并成功分離出了芳樟醇脫水異構酶，測定出該酶的分子質量為160 kDa，由4 個亞基組成。Ullah[57]和Bell[58]等分別發現，在假單胞菌（Pseudomonas putida）和新鞘氨醇桿菌（Novosphingobium aromaticivorans）中存在使里那醇轉化為氧合里那醇的酶，但到目前為止，鮮見關于釀酒酵母中單萜化合物轉化酶的報道。

3.2 糖苷結合態單萜化合物的釋放

糖苷結合態風味化合物的分析步驟包括分離、水解、測定等[45-46,59]。首先需要對酒花或啤酒中糖苷結合態單萜化合物進行吸附、分離，常用吸附劑包括Amberlite XAD-2樹脂、反相硅膠等，常用洗脫劑有乙醇、戊烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等。Kollmannsberger等[45]加入內標苯基-β-D-葡糖苷后，用熱水或甲醇-水（體積比4∶1）提取酒花中的糖苷化合物，然后將提取物用交聯聚乙烯吡咯烷酮處理，再經過濾并濃縮干燥，用戊烷-二氯甲烷（體積比2∶1）萃取揮發性化合物。最后在Amberlite XAD-2樹脂上分級分離后，將甲醇洗脫液濃縮至干，即制得糖苷提取物。對糖苷結合態化合物進行鑒定，常用技術包括高效液相色譜、尺寸排阻色譜、逆流色譜等。獲得物質單體后，可進一步對其結構進行分析鑒定，常用技術包括質譜檢測法、傅里葉變換紅外光譜法、核磁共振等方法[59-60]。

糖苷結合態單萜化合物通過糖苷酶或酸的作用裂解糖苷鍵釋放出游離態單萜化合物并進一步發生前文所述的分子間相互轉化。通過對糖苷結合態風味前體物進行水解，可獲得相應的糖配體和糖苷配基，對糖配體的測定可知糖苷結合態單萜化合物的總含量，對糖苷配基的研究可了解組成糖苷的單萜化合物種類和含量等。糖苷的水解方式分為酸水解和酶促水解[46]。其中，酸水解簡單易行，但對產物的影響較大，可能導致單萜化合物發生重排，若水解溫度過高，甚至會產生不良風味；而酶促水解所需條件溫和，產物更接近實際狀態。其中對單糖苷類單萜化合物而言，需要相應的β-D-葡萄糖苷酶作用打開糖苷鍵，釋放出揮發性的單萜化合物組分。

4 結 語

單萜化合物是酒花和啤酒中揮發性化合物的重要組成部分，是表征酒花典型特征的香氣化合物。隨著近年來國內精釀啤酒的興起和流行，尤其是晚投和干投酒花工藝的采用，單萜化合物對于啤酒釀造的意義更加凸顯。單萜化合物的組成和來源十分復雜，主要以游離態和糖苷結合態兩種形式存在于酒花和啤酒中。當前，各種新型分析技術不斷涌現，為深入研究酒花和啤酒中單萜化合物的香氣特征、結構鑒定以及組成變化等提供了更多有效的技術手段。

目前，我國的酒花產業發展亟待完善。深入調查我國現有主栽酒花品種以及重要野生酒花品種中游離態和結合態單萜化合物的組成和香氣特征，對于充分利用和深入挖掘我國地方酒花品種的釀造品質具有指導意義；同時，進一步考察酒花栽培措施、啤酒釀造工藝對單萜化合物組成的影響，對于全面評價和提升酒花和啤酒的香氣品質具有重要的實際應用價值。

研究酒花中單萜化合物的代謝途徑及其調控網絡將是一項極具挑戰性的工作。隨著功能基因組學的發展，將轉錄組學和代謝組學方法在酒花單萜合成途徑中進行結合研究，有可能成為尋找單萜化合物代謝相關基因的有效途徑。目前，關于酒花單萜化合物代謝途徑的研究熱點主要集中在通過基因重組技術優化酒花單萜合成代謝途徑中的關鍵反應步驟，和使用工程菌株作為載體表達獲取大量相關酶和特定的單萜產物兩方面。后續研究可以從限速酶、轉錄因子、轉運蛋白以及代謝途徑的限制作用等方面進一步闡明上述代謝途徑的分子調控機制。