玉米黃素對衣霉素誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

魏 俊，趙范范，劉馨君，勞鳳學，黃漢昌，商迎輝*

（北京市生物活性物質和功能食品重點實驗室，北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023）

近年來，隨全球老齡化形勢的加劇，阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）作為一種高發態勢的神經退行性疾病引起社會各屆廣泛關注[1-4]。AD的病理機制眾多，其中，內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）被認為在AD的形成及神經細胞的凋亡中具有重要作用[5-6]。ERS是生物體內錯誤折疊或未折疊蛋白質數量增多，內質網蛋白質負荷加大、內穩態失衡時的一種應激性反應[7-8]。短期的ERS誘發細胞的未折疊蛋白應答（unfolded-protein response，UPR）反應，可促進異常折疊蛋白質的降解，是細胞的一種保護性機制[9]，而長期過度的ERS則使細胞內穩態難以恢復，導致細胞死亡[10-11]，大腦神經元缺失是促進AD病理的形成和發展的關鍵因素。近期研究顯示，ERS過度反應可激活γ-裂解酶，繼而引起β-淀粉樣蛋白水平升高，導致神經細胞凋亡[12]。因此，尋找合適的藥物或者生物活性物質抑制ERS反應，提高細胞的存活率可作為治療AD的新方向。

圖1 玉米黃素的分子結構Fig. 1 Molecular structure of zeaxanthin

玉米黃素（zeaxanthin）是一種類胡蘿卜素，具有保護視力、預防心血管疾病、抗衰老及增強免疫力等功效[13-14]。此外，最新研究從分子結構（圖1）上指出類胡蘿卜素等存在酮κ-環和β-環（如玉米黃素）的理化性質，可能防止β-淀粉樣蛋白的聚集，因此，玉米黃素等類胡蘿卜素可能有治療AD的潛力[15]。衣霉素（tunicamycin，TM）是一種天然抗生素，已在體外實驗中廣泛應用于誘導內質網應激[16-19]，激活的內質網隨后可觸發細胞的凋亡通路，促使細胞死亡[20]。SH-SY5Y細胞為神經母細胞瘤細胞，廣泛用于神經退行性疾病細胞模型的建立[21]。本實驗用TM處理創建SH-SY5Y細胞損傷模型，用不同濃度的玉米黃素對損傷模型進行預處理或后處理，測定細胞存活率和細胞毒性，來研究玉米黃素對內質網應激引起的細胞損傷的保護作用，為開發玉米黃素的功能性食品及AD等神經退行性疾病的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃素（純度為85.7%，高效液相色譜法鑒定，臨用時用無水乙醇溶解成30 mmol/L的儲存液） 上海源葉生物科技有限公司。

SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；RPMI 1640培養基 美國Gibco公司；胎牛血清、胰酶 美國Hyclone公司；雙抗（青霉素-鏈霉素） 北京Solarbio公司；TM（采用二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解，配制成10 μg/μL的儲存液，-20 ℃保存，應用時采用培養基稀釋至所需終質量濃度） 北京華越洋生物科技有限公司；噻唑藍美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Varioskan Flash多功能酶標儀、ND-1000型紫外-可見分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；E191IR型CO2細胞培養箱美國金西盟公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y細胞培養

SH-SY5Y神經母細胞瘤細胞復蘇后于37 ℃、5% CO2條件下用含有體積分數10%胎牛血清和質量分數1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基培養，取對數生長期細胞進行實驗。細胞覆蓋率達到70%～80%時進行傳代，根據細胞的生長速度定時更換培養液，加藥時換成不含血清的培養液。

1.3.2 細胞內質網應激損傷模型的建立

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后按1×104個/孔接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，當細胞達到貼壁狀態時，棄去上清液，加入由RPMI 1640培養基配制成的不同濃度梯度的TM溶液，每個梯度8 個平行。TM培養36 h后，進行檢測，以此來確定TM損傷的最佳處理濃度。

1.3.3 玉米黃素處理及分組

細胞培養過程同1.3.1節，得出TM最佳損傷濃度和時間后，用此濃度建立細胞損傷模型。玉米黃素處理及分組：空白組（不做處理）、損傷組（僅TM處理）、玉米黃素保護組（玉米黃素預處理及后處理）。玉米黃素預處理組使用2、5、10、15、20、100 μmol/L的玉米黃素預處理一定時間后加TM處理36 h，以此篩選玉米黃素的最佳作用濃度，后續用濃度為2、5、10 μmol/L的玉米黃素預處理1、2、3、4、5、6、12、24 h后檢測細胞存活率。玉米黃素后處理組先用TM處理30 min，再加不同濃度的玉米黃素處理24 h后進行檢測。

1.3.4 細胞活性檢測

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后按1×104個/孔接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養 24 h，經分組處理后，每孔加入噻唑藍溶液使其終質量濃度為5 mg/mL，37 ℃繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，每孔加入150～200 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。放入酶標儀，于570 nm波長處測定OD值，按公式（1）計算細胞存活率。

1.3.5 細胞毒性檢測

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后按1×105個/孔接種于24 孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，當細胞達到貼壁狀態時，棄去上清液，細胞玉米黃素處理及損傷模型建立同1.3.3節。吸取各組培養液20 μL，用LDH試劑盒進行檢測。空白組細胞用3%的Triton X-100裂解后測定LDH活力。LDH釋放率按公式（3）計算。

1.4 數據處理

測定數據以平均值±標準差表示，用SPSS 19.0和Origin 7.5軟件進行數據處理。實驗組與對照組比較采用單因素方差分析并用Bonferroni法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 TM損傷濃度的篩選

圖2 不同質量濃度的TM對SH-SY5Y細胞活性的影響Fig. 2 Dose-dependent effect of TM on the viability of SH-SY5Y cells

SH-SY5Y細胞用不同濃度的TM溶液培養36 h，由圖2可知，不同質量濃度TM對SH-SY5Y細胞的生長均有一定抑制作用，且細胞存活率隨TM質量濃度的升高呈下降趨勢。與空白組相比，TM質量濃度為2 μg/mL時開始出現極顯著抑制作用（P＜0.01），當TM質量濃度為4、6 μg/mL時，SH-SY5Y細胞的存活率分別為68.97%和47.73%，因此可選擇兩者的中間質量濃度5 μg/mL作為后續實驗的損傷處理質量濃度。當TM質量濃度太低時，不能有效抑制細胞增殖，而TM質量濃度過高則會引起細胞死亡過量，因此建立細胞損傷模型時，選用5 μg/mL TM處理36 h。

2.2 玉米黃素濃度的篩選

玉米黃素是含紫羅酮環的二羥基類胡蘿卜素，它的兩個紫羅酮環都是β型，C5和C6間的β-紫羅酮環雙鍵與共軛多烯鏈結合在一起（圖1），這種結構可能防止形成β-淀粉樣蛋白聚集，具有治療AD的潛力。為檢測玉米黃素對SH-SY5Y細胞的保護作用，用不同濃度的玉米黃素預處理6 h后再加入5 μg/mL TM。由圖3可知，2、5、10 μmol/L的玉米黃素預處理組細胞存活率均高于TM損傷組，其中5 μmol/L時存活率顯著升高（P＜0.05），但玉米黃素濃度為20 μmol/L時細胞存活率（65.20%）低于損傷組（70.75%），且玉米黃素濃度為100 μmol/L時細胞存活率極顯著低于損傷組（P＜0.01）。說明玉米黃素濃度過高對細胞會有損傷作用，因此，選擇后續實驗的玉米黃素濃度為2、5、10 μmol/L，5 μmol/L最佳。

圖3 不同濃度玉米黃素預處理對TM引起的SH-SY5Y細胞損傷的影響Fig. 3 Dose-dependent effect of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3 玉米黃素預處理對細胞活性的影響

圖4 玉米黃素預處理時間對TM引起的SH-SY5Y細胞損傷的影響Fig. 4 Effect of pretreatment time of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

如圖4A所示，玉米黃素預處理1、2 h的細胞存活率與TM損傷組相比無明顯變化（P＞0.05），由圖4B可知，玉米黃素預處理3、4 h后細胞存活率高于TM損傷組，其中預處理4 h有顯著性差異（P＜0.05），圖4C中，玉米黃素預處理5、6 h后細胞存活率均顯著高于TM損傷組（P＜0.05），其中預處理6 h的保護作用更加明顯（P＜0.01）。由圖4D可知，與TM損傷組相比，玉米黃素預處理12 h后細胞存活率顯著升高（P＜0.05），與預處理6 h組一樣，當玉米黃素濃度為5 μmol/L時，細胞存活率的升高具有極顯著差異（P＜0.01），預處理12 h后的細胞存活率開始下降。因此，玉米黃素預處理的時長對細胞活性也有一定的影響，預處理時長為4～12 h，玉米黃素（5 μmol/L）均能緩解TM導致的細胞存活率降低作用，其中玉米黃素5 μmol/L預處理6 h效果最為顯著。

2.4 玉米黃素后處理對細胞活性的影響

圖5 玉米黃素后處理對TM引起的SH-SY5Y細胞損傷的影響Fig. 5 Effect of post-treatment time of zeaxanthin on cell viability of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.3節結果顯示玉米黃素能緩解TM導致的細胞存活率的降低，為探究玉米黃素能否逆轉TM引起的細胞損傷，SH-SY5Y細胞先用5 μg/mL TM培養30 min，再用2、5、10 μmol/L的玉米黃素后處理24 h，存活率檢測結果顯示，單獨TM損傷30 min的細胞存活率下降了14.1%（P＜0.001），而玉米黃素后處理組的細胞存活率均顯著高于損傷組（P＜0.05）（圖5）。此結果說明，玉米黃素不僅能減輕TM引起的細胞損傷作用，并且在一定程度上可逆轉TM引起的損傷。

2.5 玉米黃素預處理對細胞毒性的影響

圖6 玉米黃素預處理對TM引起的SH-SY5Y細胞LDH活力的影響Fig. 6 Effect of pretreatment of zeaxanthin on LDH activity of SH-SY5Y cells damaged by TM

細胞損傷而造成的細胞膜結構的破壞會導致胞漿內的LDH釋放到培養液中，因此檢測培養液中的LDH活力，就可以反映細胞膜結構的完整性和損傷程度，用于細胞毒性的檢測。由圖6可知，TM損傷處理后，胞漿內LDH的釋放率（培養液中的LDH活力）較空白組極顯著增加（P＜0.01）。之前結果顯示預處理6 h對細胞存活率的保護作用最佳，因此選用玉米黃素的預處理時間為6 h。與損傷組相比，2、10 μmol/L玉米黃素預處理組LDH釋放率均降低（P＜0.05），5 μmol/L處理組LDH釋放率極顯著低于損傷組（P＜0.01），說明玉米黃素能拮抗TM對SH-SY5Y細胞的應激損傷。

2.6 玉米黃素后處理對細胞毒性的影響

圖7 玉米黃素后處理對TM引起的SH-SY5Y細胞LDH釋放率的影響Fig. 7 Effect of post-treatment of zeaxanthin on LDH activity of SH-SY5Y cells damaged by TM

SH-SY5Y細胞先用5 μg/mL TM培養30 min，再用2、5、10 μmol/L的玉米黃素后處理，24 h后檢測LDH的釋放量。如圖7所示，與空白培養液組相比，TM損傷組細胞培養液中的LDH釋放率顯著升高（P＜0.05），表明TM使細胞受損引起了LDH外漏。與TM損傷組相比，玉米黃素各劑量組細胞培養液中LDH釋放率有所下降，其中2、5 μmol/L玉米黃素后處理組下降顯著（P＜0.05），表明玉米黃素后處理可以減緩細胞膜受損程度，阻止細胞內LDH外漏。10 μmol/L玉米黃素處理后LDH的釋放率較損傷組雖有下降，但無顯著性差異。

3 討 論

AD作為一種中樞神經系統退行性疾病，已經與腦卒中、腫瘤、心腦血管病相匹敵，成為老年人的第四大殺手[22-23]。近幾十年來，關于AD的藥物開發及臨床治療成果甚微，并且由于AD發病時間晚，目前尚無明確的特異性指標對其進行檢測，容易錯過最佳治療時期，因此目前對于AD的研究已經逐漸從治療到預防的方向轉變[24-25]，對AD的早期預防成為焦點。營養學上認為早期補充含有益生物活性物質的膳食有助于預防AD[26]；病理學方面，在AD患者大腦未出現病理狀態的神經元中發現ERS的標志蛋白表達增多的現象[27]，這說明ERS發生于AD的早期階段。此外ERS會引起神經細胞Ca2+穩態失衡，過氧化物增多等一系列生理功能的變化，還能激活UPR的凋亡信號通路，在AD的形成及神經細胞的凋亡中具有重要作用。因此，尋找合適的生物活性物質抑制ERS反應對AD的早期控制和病理抑制具有重要意義。

最新研究表明類胡蘿卜素可在治療神經退行性疾病中發揮有益作用[28-29]，指出玉米黃素可能具有抗β-淀粉樣蛋白聚集的作用，并且對內質網應激有一定的緩解作用，動物實驗證明，玉米黃素能夠緩解高糖引起的小鼠認知功能的損傷[30-31]。結合以上研究，推測玉米黃素可能具備預防和治療AD的潛力。

本實驗通過TM誘導SH-SY5Y細胞損傷來建立內質網應激損傷模型，以此探究玉米黃素在AD治療中的潛力。結果表明，TM濃度為5 μmol/L時，能夠對SH-SY5Y細胞造成有效的損傷。TM能夠抑制細胞內合成N寡聚糖的第一步反應，從而阻止蛋白質的成熟，并引起ERS，長期過度的ERS使內質網負荷加大，引起細胞死亡。研究顯示，2～10 μmol/L玉米黃素能夠減輕TM的損傷作用，提高細胞存活率，降低LDH的釋放率，并且在一定程度上可逆轉TM引起的損傷。預處理時間的研究表明，一定濃度的玉米黃素預處理時長在4～12 h時可以有效緩解TM引起的細胞死亡，且當玉米黃素濃度為5 μmol/L，預處理6 h時保護效果最好。本實驗表明，玉米黃素可有效改善內質網應激引起的細胞損傷并維持細胞膜的完整性。但玉米黃素能否改善內質網應激引起的其他變化，如細胞凋亡相關蛋白的表達以及細胞核的形態變化仍需進一步探索，且玉米黃素究竟通過哪一通路抑制內質網應激尚不明確，還需進一步研究。