土家族腦卒中患者MTHFR、MTRR67基因單核苷酸多態性及其與血清同型半胱氨酸水平的關系

熊小平，譚小燕，馮云，楊章琴，李銳，田小龍

(重慶市黔江中心醫院，重慶409000)

腦卒中為腦血管破裂或閉塞后引起突發神經功能缺損的一類臨床綜合征，是致殘致死率極高的疾病之一,分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1]。腦卒中高危因素包括遺傳基因、高血糖、不良生活方式、高血壓、高脂血癥等，與心血管疾病高危因素相似[2]。研究證實，高同型半胱氨酸血癥為心血管疾病及腦卒中獨立高危因素[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝過程中的關鍵酶，其中MTHFR基因最常見突變位點為677、1298位[4～7]，MTRR基因最常見突變位點為66位，兩種基因不同位點突變均會導致血漿同型半胱氨酸水平升高。但是，MTHFR、MTRR基因突變與腦卒中的發病是否有關目前的研究結果尚無定論。另有研究[8]表明，MTHFR基因677位點的等位基因和基因型分布具有較強的地域和人種特征，突變型T等位基因頻率由低到高依次為非洲人、歐洲白人、中東人、中國漢族人、墨西哥。國內研究[2，5，9]結果也顯示，不同民族、不同地區間MTHFR基因677、1298位點基因型分布存在明顯差異。重慶市黔江區為土家族聚集區，有獨特的民族特點，該地區腦卒中發病率也有逐年上升趨勢，目前尚無針對該民族腦卒中患者MTHFR、MTRR基因多態性研究,我們就該地區土家族腦卒中患者MTHFR、MTRR基因SNP及其與同型半胱氨酸水平的關系進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年9月～2018年8月在黔江中心醫院住院治療的土家族腦卒中患者92例(腦卒中組),均符合《2016中國腦血管病診治指南及專家共識》中的腦卒中診斷標準。男49例、女43例，年齡(63±14)歲。糖尿病38例、高血壓72例，高血脂47例。病程<7 d。其中，腦出血9例，腦梗死68例，短暫性腦缺血發作15例。納入標準：年齡40～80歲；有明確的腦血管疾病的定位體征如偏癱、肢體麻木、失明、失語、吞咽困難、感覺障礙等；影像學檢查診斷明確。排除動脈瘤、血液系統疾病、腫瘤、外傷、心源性栓塞等疾病。選擇同期本院體檢健康土家族人員140例作為對照組，男88例、女52例，年齡(61±15)歲。納入標準：年齡40～80歲；無腦血管病病史；頭顱MR提示無腦卒中證據。兩組年齡、性別有可比性。

1.2 MTHFR、MTRR基因不同位點單核苷酸檢測及基因分型 ①DNA提取及擴增：采集受檢者口腔黏膜上皮脫落細胞，采用硅膠吸附法提取基因組DNA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司使用HPLC純化方法合成。PCR反應體系： 1 μL基因組DNA(20 ng/μL)，5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探針(MTHFR677T/C GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA；MTHFR 1298C/A AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T]CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA；MTRR 66G/AAGGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT[A/G]TGTGAGCAAGCTGTGGTACATGGAT)，3.5 μL去離子水，總反應體積為10 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，20個循環；89 ℃變性15 s，60 ℃延伸90 s，30個循環。②單核苷酸檢測及基因分型：將PCR擴增完成樣品置于ABI QuantStudio DX熒光定量PCR儀上讀取樣品孔的終點熒光，并使用QuantStudio DX Software分析軟件實現對MTHFR C677T的野生純合型(CC)、雜合型(CT)、突變純合型(TT)，MTHFR A1298C的野生純合型(AA)、雜合型(AC)、突變純合型(CC)與MTRR A66G的野生純合型(AA)、雜合型(AG)、突變純合型(GG)的SNP分型，相關儀器及試劑均購于美國AB公司。

1.3 血清同型半胱氨酸水平檢測 空腹條件下采集血液2 mL至ED-TAK3抗凝管中，于3 000 r/min、4 ℃離心機中離心10 min(采血后1 h內完成離心)，分離上層血漿。采用高效液相色譜法檢測血清同型半胱氨酸，檢測值> 15 μmol/L定義為高同型半胱氨酸血癥。

2 結果

2.1 兩組MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點基因型、等位基因分布比較 兩組各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(MTHFR基因677位點：χ2分別為0.028、0.13，P均>0.05；MTHFR基因1298位點；χ2分別為0.02、0.23，P均>0.05；MTRR基因66位點：χ2分別為5.07、2.98，P均>0.05)，具有群體代表性。MTHFR基因667位點等位基因分別為CC、TT、CT；兩組基因型及等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2分別為1.32、1.08，P分別為0.25、0.58)，結果詳見表1。MTHFR 1298位點等位基因分別為CC、AA、AC型；兩組基因型及等位基因分布比較差異無統計學意義(χ2分別為0.49、0.77，P分別為0.48、0.68)，結果詳見表2。MTRR基因66位點等位基因分別為AA、AG、GG型。與對照組相比，腦卒中組MTRR基因66位點GG基因型比率上升，AG基因型比率下降(χ2=15.13,P<0.01;χ2=5.58,P<0.05)；兩組等位基因分布比較，χ2=0.96，P=0.33；結果詳見表3。MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點SNP與腦卒中發生無明顯相關性(OR分別為1.13、1.06、1.25，95%CI分別為0.81～1.58、0.58～1.91、0.79～1.99；P均>0.05)。

表2 兩組MTHFR 1298位點基因型及等位基因分布

表3 兩組MTRR基因66位點基因型及等位基因分布

2.2 MTHFR基因677、1298位點及MTRR基因66位點不同基因型腦卒中患者血清同型半胱氨酸水平比較 232例受試者MTHFR基因677位點基因型為CC、TT、CT者血清同型半胱氨酸水平分別為(14.36±0.78)、(24.67±5.59)、(15.12±0.69)μmol/L；MTHFR 1298C/A基因型為CC、AA、AC者血清同型半胱氨酸水平分別為(14.14±2.13)、(18.08±1.58)、(13.23±0.77)μmol/L；MTRR基因66位點基因型為AA、AG、GG者血清同型半胱氨酸水平分別為(15.23±0.87)、(16.45±1.95)、(21.84±5.13)μmol/L。MTHFR基因677位點TT基因型血清同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型(P均<0.05)。MTHFR基因1298位點及MTRR基因型66位點不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統計學意義(F1=2.16,F2=1.67;P均>0.05)。

3 討論

MTHFR基因定位于染色體1p36.3[4]，其突變可導致酶需熱性和活性減低，主要功能為催化5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，其基因突變會導致同型半胱氨酸復甲基化障礙，使得血清同型半胱氨酸濃度升高，從而導致多種疾病發生。目前MTHFR基因多態性與缺血性腦卒中關系存在爭議[10,11]，一部分研究[12]認為該基因與腦卒中發病有關，甚至與兒童卒中發病也存在一定關系；但另一部分研究[13]認為，MTHFR基因突變與腦卒中發病無關。本研究發現，腦卒中患者MTHFR基因677位點TT基因型同型半胱氨酸水平高于CC、CT基因型，說明MTHFR基因677位點TT基因型與高同型半胱氨酸血水平有關；但是，MTHFR基因677、1298位點SNP與腦卒中之間無明顯相關性。表明雖然MTHFR基因677位點突變可能降低亞甲基四氫葉酸還原酶的活性，引起同型半胱氨酸升高，但并非腦卒中的高危因素，與文獻[14]報道結果一致。本研究結果顯示，卒中組MTHFR基因1298位點各基因型分布與對照組相比差異無統計學意義，不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統計學意義，且與腦卒中發生無關聯，與文獻[15]報道相似。說明MTHFR基因1298位點突變可能與高同型半胱氨酸血水平及腦卒中發生無關。

MTRR為蛋氨酸代謝中的一個關鍵酶，基因錯義突變是引起此酶缺乏或活性降低的主要原因,其中66位堿基突變最常見，其主要作用是維持血漿同型半胱氨酸濃度，66位點基因變異可引起血漿同型半胱氨酸濃度升高[16～18]。文獻報道，朝鮮族及漢族MTRR基因66位點GG基因型頻率分別為11.11%及5.03%，朝鮮族人群中MTRR基因66位A突變為G增加腦卒中風險。本研究中，黔江區土家族腦卒中患者MTRR基因66位點GG亞型頻率高達19.6%，高于文獻報道的朝鮮族及漢族，說明黔江區土家族該基因的分布具有自身民族特點，可能存在連鎖不平衡現象，需進一步研究證實。本研究發現，與對照組比較，卒中組MTRR 66位點GG型基因比率上升，提示腦卒中患者MTRR 66位點GG基因型可能增加患者的卒中風險，但Logistic分析顯示該基因OR值為1.25，與腦卒中發生無關聯性，提示該基因可能不是腦卒中的獨立危險因素[19]。MTRR基因型66位點不同基因型之間血清同型半胱氨酸水平相比差異均無統計學意義，說明MTRR基因型66位點突變與高同型半胱氨酸水平無關。

總之，土家族腦卒中患者MTRR基因66位點GG基因型比率上升，AG基因型比率下降；MTHFR基因677位點TT基因型與腦卒中患者高同型半胱氨酸水平有關；MTHFR、MTRR基因SNP與腦卒中發生無關。鑒于本研究中納入的研究樣本偏少，可能存在實驗偏差，仍需進一步擴大樣本量以明確上述兩種基因SNP與高同型半胱氨酸水平及腦卒中的關系。