1，25（OH）2D3通過調節 miR－146a水平抑制大鼠肝纖維化的體內和體外觀察*

周麗云，李校天，李麗，楊俊超

肝星狀細胞（HSC）的活化在肝纖維化的形成過程中起著重要作用[1-4]。miRNAs是一類長度約18～25 nt的調控轉錄后基因表達的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物，也包括單細胞生物體內，參與細胞的分化、增殖和凋亡[5]。1，25（OH）2D3是維生素 D在體內的最終代謝形式，是維持機體鈣和骨鹽平衡的重要成分，在免疫調節、抗氧化、抗炎癥反應等方面發揮著重要作用。本研究檢測了CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝組織miR-146a水平，并在體外檢測了轉染miR-146a模擬劑/抑制劑并經TGF-β1誘導活化的HSC的增殖和活化情況，以進一步探討1，25（OH）2D3抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 48只SD大鼠【河北醫科大學動物實驗中心（合格證編號:1602111）】，體質量為（200±20）g，隨機分為對照組、CCl4模型組、橄欖油組和1，25（OH）2D3干預組，每組12只。給予大鼠50%CCl4（上海麥克林生物科技有限公司）3 ml·kg-1皮下注射，2次/w，連續8 w，建立肝纖維化模型，在對照組，給予等量的橄欖油溶媒皮下注射。自造模之日開始，在干預組，分別給予橄欖油溶媒或1，25（OH）2D3溶液（美國Peprotech 公司）3 ml·kg-1灌胃，1次/d。在實驗第8 w，實驗動物禁食12 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經心臟取血，4℃ 12000 r/m離心5 min，分離血清。打開腹腔，取肝組織，4%多聚甲醛固定，用于石蠟包埋制作病理學切片，采用Metavir法行肝纖維化分期評估。另取部分肝組織用液氮快速冷凍，置于-80℃冰箱保存，以備提取miR-146a。

1.2 細胞培養 取HSC細胞（中國科學院上海生命科學院細胞資源中心），用1640培養液加10%小牛血清（FBS，美國Invitrogen公司）、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，培養于37℃含5%CO2培養箱中，每24～48 h換液。待細胞長滿至T25培養瓶中約80%～90%時，胰酶消化傳代。當傳至3～4代時，使用10 pmmol/l TGF-β1（美國Sigma公司）作用細胞24 h，將細胞分為：①TGF-β1刺激組：用含10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；②轉染miR-146a模擬劑組：用50 nM miR-146a模擬劑（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/L TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；③轉染miR-146a模擬劑對照組（廣州銳博生物科技有限公司）：用50 nM miR-146a模擬劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；④轉染miR-146a抑制劑組：用100 nM miR146a抑制劑（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；⑤轉染miR-146a抑制劑對照組：用100 nM miR146a抑制劑對照物（廣州銳博生物科技有限公司）/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；⑥1，25（OH）2D3干預組：用 2.5×10-6mmol/l 1，25（OH）2D3/0.1%DMSO 溶劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞；⑦DMSO組：以 0.1%DMSO溶劑/10 pmmol/l TGF-β1/10%FBS的1640培養基培養細胞。根據我們前期工作基礎，設置藥物濃度及培養時間，每組設5個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h。

1.3 肝組織miR-146a水平檢測 采用qPCR法。采用U6大鼠miR-146a源引物為內參照，采用SYBR Green I實時定量PCR法檢測miR-146a相對水平，miR-146a引物為：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGG TT-3’，下游引物為 5’-ATCTACTCTCCAGGTCCTCA-3’；內參基因 U6small nuclear RNA（snRNA）的上游引物為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 轉染miR-146a模擬劑和miR-146a抑制劑 瞬時離心miR-146a模擬劑、miR-146a模擬劑對照物、miR-146a抑制劑和miR-146a抑制劑對照物。用滅菌ddH2O配制成20 μM儲存液，分裝保存，用 1×riboFECTTMCP Buffer 30 μl分別稀釋 20 μM miR-146a模擬劑、miR-146a模擬劑對照物、miR-146a抑制劑和miR-146a抑制劑對照物1.25 μl，輕輕混勻，加入riboFECTTM CP Reagent 3 μl，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15 min。棄掉24孔板中的培養液，加入新的無血清培養基，將CP混合液加入到新的培養基中，輕輕混勻。將培養板置于37℃的CO2培養箱中培養24 h。

1.5 細胞增殖檢測 采用CCK8法，將HSC-T6細胞接種于96孔板，體積100 μl，每組做3個復孔，待細胞長至80%時，按照上述分組進行干預。干預24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，培養箱內孵育1 h左右，測定450 nm吸光度。細胞增殖率=（實驗孔-空白孔）/（對照孔-空白孔）×100%。

1.6 細胞凋亡檢測 使用流式細胞術檢測，取對數生長的細胞，按上述分組干預24 h，倒去培養液，胰酶消化，用培養液輕輕吹打，4℃ 1200 r/m離心5 min，棄上清，PBS洗2次，用Binding Buffer 500 μl重懸細胞，細胞數為5×105。用孔徑為40～50 μm的300目尼龍網過濾細胞，加入AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育5 min，上機進行細胞凋亡檢測。

1.7 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，組間顯著性差異分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組SD大鼠血清ALT和AST水平比較 經1，25（OH）2D3處理，動物血清 AST 和 ALT 水平顯著低于模型組（P＜0.05，表1），說明 1，25（OH）2D3具有保護大鼠肝功能，減輕肝損傷的作用。

表1 各組大鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

表1 各組大鼠血清ALT和AST水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05；與橄欖油組比，②P＜0.05

ALT（U/L） AST（U/L）對照組 10 29.3±6.0 20.3±9.0模型組 10 353.3±128.6① 423.3±263.9①1，25（OH）2D3 11 86.7±12.6①② 56.7±15.3①②橄欖油組 12 376.7±150.4 416.7±255.4只

2.2 各組肝組織病理學表現 Masson染色結果顯示，經 1，25（OH）2D3灌胃干預后，SD 大鼠肝組織可見正常的肝小葉結構，炎性浸潤情況較橄欖油灌胃組明顯減輕，匯管區纖維條索較橄欖油灌胃組明顯變細，說明1，25-OH）2D3具有抑制大鼠肝組織炎癥反應作用。

2.3 各組大鼠肝組織miR-146a水平變化 經1，25（OH）2D3灌胃干預組大鼠肝組織miR-146a水平較橄欖油處理組明顯上調（P＜0.05）。

2.4 各組細胞轉染miR-146a情況 結果顯示轉染miR-146a模擬劑組細胞miR-146a相對水平較轉染miR-146a模擬劑對照物組顯著增高，轉染miR-146a抑制劑組miR-146a相對水平較轉染miR-146a抑制劑對照物組顯著降低，差異均具有統計學意義，提示轉染成功。1，25（OH）2D3干預 HSC中miR-146a水平較 DMSO組明顯增加（P＜0.05），提示 1，25（OH）2D3可上調細胞 miR-146a水平。

2.5 各組細胞增殖率比較 分別以2.5×10-6mmol/L 1，25（OH）2D3和 DMSO 處理細胞，以只含有 1640 培養基組為空白對照，處理 24 h 后，1，25（OH）2D3組細胞增殖率為58.8%，較DMSO組下降了15.9%；轉染miR-146a模擬劑組細胞增殖率為46.5%，較轉染miR-146a模擬劑對照組下降了53.3%；轉染miR-146a抑制劑組HSC增殖率為132.8%，較轉染miR-146a抑制劑對照物組升高了約32.8%，提示1,25（OH）2D3可抑制由TGF-β1刺激的HSC增殖。

2.6 各組細胞凋亡情況比較 1,25（OH）2D3干預細胞凋亡率為12.6%，比DMSO組細胞凋亡率提高了5.1%，與對照組比，細胞凋亡率增加了6.3%；轉染miR-146a模擬劑組細胞凋亡率為16.8%，與轉染miR-146a模擬劑對照物組比，細胞凋亡率增加了8.2%；與對照組比，轉染miR-146a模擬劑組細胞凋亡率增加了10.4%；轉染miR-146a抑制劑組細胞凋亡率為6.3%，與轉染miR-146a抑制劑對照物組比減少了 2.2%，提示 1，25（OH）2D3可促進由 TGF-β1刺激的HSC細胞凋亡（圖1）。

圖1 各組HSC凋亡情況

3 討論

近年研究表明，miRNA參與肝纖維化的發生和發展過程，有望成為肝纖維化診斷及干預的靶點[8]。miR-146a是miRNA家族的一員，位于人類5號染色體LOC285628基因的第二外顯子上。2006年，Baltimore團隊首先報道了miR-146a可通過NF-κB信號通路抑制機體的免疫反應[9]。隨后，不斷有研究報告指出其與機體自身免疫、炎癥、病毒感染等有著錯綜復雜的關系。研究發現miR-146a水平的異常與病毒復制、肝細胞再生、炎癥反應，甚至肝細胞癌的發生發展有密切的聯系[10-14]。

1，25（OH）2D3與各種肝臟疾病的發生、發展有關，在免疫調節、抗炎、抗氧化、抗纖維化等方面均有不同程度的作用。研究發現，1，25（OH）2D3可通過降低miR-27b水平從而抑制肺纖維化進程[15]，還可通過調節miRNA表達，誘導皮膚鱗癌細胞凋亡[16]。國內亦有用它來干預硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化的報道[17]。我們采用10pmmol/L TGF-β1誘導HSC活化，再轉染miR-146a模擬劑或miR-146a抑制劑。結果發現1，25（OH）2D3干預HSC細胞增殖較對照組明顯降低，而轉染miR-146a模擬劑組HSC增殖較對照組明顯降低，轉染miR-146a抑制劑組HSC細胞增殖較對照組明顯增強，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。實驗還發現 1，25（OH）2D3干預的HSC較對照組凋亡明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），轉染 miR-146a模擬劑組 HSC 凋亡較對照組明顯增加，轉染miR-146a抑制劑組HSC較對照組凋亡減少，上述差異均具有統計學意義（P＜0.05），這些結果提示活化的 HSC細胞miR-146a較靜息狀態下下降，1，25（OH）2D3具有抑制肝纖維化的作用，其機制可能與上調HSC中miR-146a水平有關。

本研究結果顯示，1，25（OH）2D3在體內體外均具有抑制肝纖維化形成的作用，并且可能通過上調HSC細胞內miR-146a水平而實現的，但其具體的信號通路還需要進一步的研究。我們將在后續的體內和體外實驗中繼續探索1，25（OH）2D3抗肝纖維化的作用機制及其miR-146a或其下游通路的作用，以期為1，25（OH）2D3用于抗肝纖維化的干預提供更多的理論和實驗依據，也為逆轉肝纖維化提供更多的藥物干預思路，從而阻斷肝纖維化的進展。