間充質(zhì)干細胞移植干預(yù)2-OA/BSA誘導(dǎo)的原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠肝內(nèi)膽管上皮細胞自噬蛋白表達的變化*

朱赟，姚根宏，唐小軍

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種慢性進展性膽汁淤積性自身免疫性肝病，特異性損傷肝內(nèi)膽管上皮細胞（intrahepatic biliary epithelial cells，IBECs）。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植干預(yù)自身免疫性疾病是一項新技術(shù)。現(xiàn)認為MSCs可下調(diào)轉(zhuǎn)錄激活因子3信號通路（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）并促進細胞自噬。本實驗采用2-辛炔酸結(jié)合牛血清白蛋白（2-octynoic acid-bovine serum albumin，2-OA-BSA）注射誘導(dǎo)PBC模型小鼠，觀察了MSCs移植對IBECs蛋白表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 30只C57BL/6小鼠購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司【SCXK（蘇）2014-0007】，6～8 周齡，體質(zhì)量為（18.5±0.9）g。胎牛血清（FBS）、培養(yǎng)基（DMEM/F12）、胰蛋白酶/EDTA溶液（購于Invitrogen公司），抗-DLAT/丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex-E2，PDC-E2） 抗體試劑盒（Lifespan Biosciences），抗微管相關(guān)蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗體、抗自噬蛋白 Belclin-1 抗體、PVDF膜、ECL 顯色液（Merck&Millipore），抗核孔蛋白 62（nucleoporin，p62）抗體、抗雙鏈 RNA依賴性蛋白激酶R（double-stranded RNA-dependent protein kinase R，PKR） 抗體（Arigo）、pPKR（Santa Cruz）、抗角蛋白19抗體（cytokeratin 19，CK19）、抗肝細胞核因子 4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF-4α，Abcam），抗 STAT3、抗 pSTAT3 抗體、抗真核始動因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）/peIF2α抗體、抗溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein，LAMP-1）抗體、抗磷酸酶抑制劑Cocktail、抗LC3II、LC3I抗體（Cell Signaling Technology），反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、PCR擴增試劑盒（大連 Takara）。CO2培養(yǎng)箱（美國Sheldon公司），倒置顯微鏡和免疫熒光顯微鏡（Olympus公司），流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 PBC模型制備與干預(yù) 取小鼠，隨機分為實驗組（n=18）、對照組（n=6）和未處理組（n=6）。在無菌條件下，在18只實驗組小鼠，取2-OA-BSA（100 μg/25 μl，北京瀚譜生物公司）加入等量CFA（Chondrex公司），腹腔注射，之后每2周腹腔內(nèi)注射2-OA-BSA+IFA。在對照組小鼠，腹腔注射BSA+CFA。22周后，隨機取模型小鼠2只、對照組小鼠和未處理組小鼠各1只，觀察造模情況。然后，將PBC模型小鼠隨機分為以下處理組：模型組（PBC組，n=4）、MSCs移植干預(yù)組（1×106臍帶間充質(zhì)干細胞，n=6）和 STAT3抑制劑干預(yù)組（n=6），取 Stattic（R&D 公司）25 mg，加入 2.5%DMSO100 ml，每只小鼠腹腔注射Stattic 150 μl。兩周后，處死所有小鼠，留取血清。

1.3 小鼠肝內(nèi)膽管樹分離 剪開腹腔，暴露肝臟，將靜脈留置針插入門靜脈，離斷下腔靜脈。用含5 mmol/L EGTA、10 mml/L HEPES和 5 μg/L 慶大霉素的Hank's液灌流2 min，清除肝內(nèi)血液；用含有0.05%B型膠原酶、0.005%胰蛋白酶抑制劑、氯化鈣、HEPES和慶大霉素的 Hank's液灌流 5～10 min；切下膽囊，取出肝臟，去掉肝臟表面包膜。將肝臟繼續(xù)放至上述消化液中消化10 min。之后，刷除肝實質(zhì)細胞，獲得膽管樹。

1.4 血清檢驗 使用全自動化學(xué)分析儀（邁瑞公司）檢測血生化指標、亮氨酸肽酶、腺苷脫氨酶和球蛋白；采用ELISA法檢測血清PDC-E2水平。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查和免疫組化檢測 取肝組織和膽管樹組織，以10%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成3 μm薄片，HE染色。在膽管樹組織，采用免疫組化法檢測CKl9和HNF-4α 表達，加3%H2O2孵育10 min，加一抗，4℃過夜，加二抗工作液，PBS沖洗 3次，加入DAB顯色。

1.6 膽管組織 LC3、p62、STAT3/pSTAT3表達的檢測 采用免疫印跡法檢測，取膽管組織，經(jīng)研磨后，提取蛋白，每個樣本分為 A、B、C，3 等分（各約 1 ml）。A份：經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，用Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置夾板，轉(zhuǎn)膜90 min，將膜分別包被在一抗溶液中，4℃孵育過夜，充分洗滌。將膜從封閉液中取出，放入雜交袋中，加入稀釋好的二抗，按1：1比例混合A液與B液，配置顯影劑，將PVDF膜的平板置于Syngene G：BOX凝膠成像系統(tǒng)，曝光拍照。以磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）作為內(nèi)參照，檢測LC3II/LC3I時，參照為β肌動蛋白（β-actin)。

1.7 肝組織LC3、p62、STAT3/pSTAT3 mRNA檢測 采用PCR法，取B份蛋白樣品，用Trizol試劑盒提取肝組織總RNA，測定RNA濃度及純度。引物序列如下：LC3 musF：5'-GCGCTTGCAGCTCAATGCTA-3'，LC3 musR：5'-GTACACTTCGGAGATGGGAGTGG-3'；p62musF：5'-GAAGCTGCCCTATACCCACATCTC-3'，p62musR：5'-TGCTTCGAATACTGGATCGTGTC-3'；STAT3musF：5'-TGCACCTGATCACCTTCGAGAC-3'，STAT3 musR：5'-CCCAAGCATTTGGCATC TGAC-3'。GAPDH musF：5'-TGGCCTTCCGTGTTC CTAC-3'，GAPDH musR:5'-GAGTTGCTGTTGAAGT CGCA-3'。每份標本各蛋白做3個復(fù)孔，以SDS 2.0軟件分析其Ct值。計算各標本平均Ct值，以GAPDH Ct值作為內(nèi)參, 采用 2-ΔΔCt計算各組基因水平。

1.8 超微結(jié)構(gòu)觀察 取C樣本，用PBS清洗3次，每次10 min，用1%～2%鋨酸固定，乙醇脫水，環(huán)氧丙烷或丙酮置換；丙酮、包埋劑浸漬、包埋，鈾染色、鉛染色，于透射電鏡（JEM 1010,日本電子公司JEOL）下觀察。

2 結(jié)果

2.1 IBEC超微結(jié)構(gòu)的變化 在BSA組，IBEC內(nèi)自噬泡和自噬溶酶體（紅色箭頭）較模型組增多（圖1），而在MSCs組和Stattic組，自噬泡、自噬溶酶體與模型組相似（圖片未顯示）。

圖1 各組IBEC超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn) 箭頭所指為自噬泡或自噬溶酶體

2.2 各組小鼠膽管樹純化情況 CK19主要表達于IBECs細胞質(zhì)，為棕褐色顆粒分布，可見含CK19的IBECs占分離膽管組織的大部分（圖2 A、B），未著色的基質(zhì)、結(jié)締組織細胞破壞、零散分布，HNF-4α特異性表達于肝細胞（圖2C），HNF-4α染色的肝細胞較少（箭頭所示），提示所分離的膽管樹含肝細胞較少。

2.3 各組IBECs自噬相關(guān)蛋白表達情況 各組小鼠IBECs內(nèi)LAMP-1陰性，模型組小鼠IBECs自噬蛋白Beclin-1、STAT3和pSTAT3表達較BSA組增強，而MSCs移植和Stattic干預(yù)組上述蛋白表達減弱（圖 3）。

圖2 小鼠膽管樹CK19和HNF-4α表達

圖3 各組IBECs自噬相關(guān)蛋白表達水平比較

2.4 各組IBECs自噬相關(guān)基因mRNA水平比較本實驗未檢測到PKR和LAMP-1 mRNA，模型組和MSCs組p62 mRNA水平較BSA組下降，模型組STAT3 mRNA水平較BSA組下降。

3 討論

目前，已建立了多種與人類PBC臨床和病理學(xué)特征類似的動物模型，包括NOD.c3c4小鼠、轉(zhuǎn)化生長因子β受體II顯性缺失小鼠模型（dnTGF-βRII）、IL-2Rα（CD25）-/-小鼠模型和Scurfy小鼠，而各自有其不足[1-3]。有人將2-OA與BSA偶聯(lián)后腹腔注射誘導(dǎo)C57B/L小鼠發(fā)生模擬人PBC發(fā)病特征的膽管損害，為我們提供了較好的研究模型[4]。PBC主要的靶損害組織為IBECs。

2-OA是人工化合物，多見于去垢劑、化妝品和食品添加劑中[5，6]。本研究在造模22周，肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小膽管破壞、匯管區(qū)炎性細胞浸潤和肉芽腫形成，符合實驗預(yù)期。

PBC模型小鼠IBECs內(nèi)STAT3和pSTAT3表達增強，而MSCs移植和Stattic干預(yù)組STAT3和pSTAT3表達均有所減弱，甚至與BSA組表達類似。編碼STAT3的基因位于人染色體17q21.31上，主要存在于細胞質(zhì)，應(yīng)激等因素可以導(dǎo)致線粒體STAT3的聚集[7-10]。胞質(zhì)STAT3在受到外界刺激發(fā)生磷酸化和二聚體化后轉(zhuǎn)移至細胞核，調(diào)控多種靶基因的表達，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡。在生物體十幾種STAT家族成員中，哺乳動物主要有STAT1-4、STAT5a、STAT5b、STAT6 等主要基因型[11，12]。STATs既是信號傳導(dǎo)子,又是轉(zhuǎn)錄因子，目前認為STAT3與肝臟的關(guān)系最為密切[13，14]。

研究發(fā)現(xiàn)STAT3能通過其SH2結(jié)構(gòu)域與eIF2α競爭性結(jié)合PKR，阻斷自噬的發(fā)生[15-17]。本研究在IBECs未能檢測出PKR，但PBC組pPKR表達較BSA組明顯增強，可能與模型組誘導(dǎo)激活I(lǐng)BECs自噬有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1表達可能與細胞損害或誘導(dǎo)自噬有關(guān)。我們同時檢測了與自噬關(guān)系密切的LC3、p62、STAT3 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)它們與蛋白表達結(jié)果相反，即在蛋白表達增強的模型組，這些基因mRNA水平卻較其他組降低，如模型組p62 mRNA和STAT3 mRNA水平較BSA組明顯降低，可能原因為：1，高水平的蛋白表達能抑制其mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯，即翻譯水平的調(diào)控可導(dǎo)致蛋白表達與mRNA水平不成比例；2，mRNA/蛋白穩(wěn)定性差，易降解，或是蛋白經(jīng)修飾、折疊后，難以測出；3，mRNA水平變化到蛋白表達的變化可能存在時間延遲，因此蛋白調(diào)控是多層次、多時空和多類型進行的。