LDL與Raw264.7細(xì)胞中腎素-血管緊張素系統(tǒng)表達(dá)

劉南 章程 武舒佳 武軍駐(通訊作者)

（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)系 湖北 武漢 430071）

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管系統(tǒng)中最常見(jiàn)的，威脅我國(guó)人民健康的慢性疾病[1]，在發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率和死亡率也很高[2]。AS是受損動(dòng)脈的病變是從內(nèi)膜開(kāi)始的。LDL參與了AS的病變過(guò)程，LDL的氧化在慢性炎癥反應(yīng)中起著極其重要的作用[3-5]。血管緊張素（Angiotensin，Ang)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的多肽，可使血管收縮，進(jìn)而導(dǎo)致血壓升高。至今為止，4種血管緊張素肽（AngI、AngII、AngIII和AngIV)和四種血管緊張素受體(AT1、AT2、AT3和AT4)已經(jīng)被鑒定[6]。無(wú)活性的AngI通過(guò)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）轉(zhuǎn)化為AngII。AngII代謝為AngIII，而后通過(guò)兩種氨肽酶轉(zhuǎn)化為AngIV。AngII和AngIII是AT1和AT2受體的完全激動(dòng)劑。AngII是最有效的效應(yīng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)血容量，血壓，外周血管張力，在維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中起重要作用[7-8]。但AngⅡ與LDL氧化之間的相互作用關(guān)系尚不清楚，本研究旨在探究LDL氧化過(guò)程中對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響，為研究AngⅡ與LDL氧化之間的相互作用關(guān)系提供一定的依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要試劑

實(shí)驗(yàn)室保存有Raw264.7巨噬細(xì)胞，LDL購(gòu)自ProSpec-Tany公司。AT2R抗體來(lái)源于Abcam公司，GAPDH抗體來(lái)源于美國(guó)EarthOx公司。小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）試劑盒、小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在含1%青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清，90%DMEM的完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2，90% 濕度，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 LDL處理

Raw264.7細(xì)胞達(dá)到80%-90%細(xì)胞密度時(shí)，換成無(wú)血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中同步化過(guò)夜，加入LDL（終濃度100μg/ml,含終濃度1μM的Cu2+），在培養(yǎng)箱中孵育不同的時(shí)間。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清。

1.4 小鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）試劑盒測(cè)定

ACE的活性 收集LDL刺激的細(xì)胞裂解后的上清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，空白孔不加；每孔加入檢測(cè)抗體-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗滌液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液，15min 內(nèi)，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD值。以測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，將ACE的OD值代入方程，計(jì)算出ACE的活性。

1.5 小鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）試劑盒測(cè)定AngⅡ的表達(dá)

收集LDL刺激的細(xì)胞裂解后的上清，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，空白孔不加；每孔加入檢測(cè)抗體-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗滌液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液，15min 內(nèi)，在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD值。以測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，將AngⅡ的OD值代入方程，計(jì)算出AngⅡ的含量。

1.6 Real-Time PCR檢測(cè)ACE mRNA的表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)β-actin上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTCACTGT-3'；下游引物為5'-GCTGTCGCCTTCACCGTTCC-3'， 設(shè) 計(jì)ACE上 游引物為5'-TACAACTCCAGCGCCGAAC-3',下游引物為5'-GCCAGATCGGTTCATACAGC-3'；逆轉(zhuǎn)錄42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5sec。隨后上機(jī)進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)。結(jié)果處理：相對(duì)定量 2–ΔΔCt法。ΔCt（對(duì)照組）= Ct（對(duì)照組目的基因）- Ct（對(duì)照組內(nèi)參基因），ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）= Ct（實(shí)驗(yàn)組目的基因）-Ct（實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。

1.7 Real-Time PCR檢測(cè)

AT2R mRNA的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA，β-actin引物同上；設(shè)計(jì)AT2R上游引物為5'-ACAGGATAACCCGTGACCAAG-3'，下游引物為5'-ACACTGCGGAGCTTCTGTTG-3'；逆轉(zhuǎn)錄42℃ 2min，37℃15min，85℃ 5sec。隨后上機(jī)進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)。結(jié)果處理：相對(duì)定量 2–ΔΔCt法。

1.8 Western Blot檢測(cè)AT2R的表達(dá)

將LDL刺激細(xì)胞后的裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE，180mA橫流轉(zhuǎn)膜2h，脫脂牛奶封閉2h，一抗4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次15min。二抗室溫孵育2h后，TBST洗滌3次，每次10min。加ECL顯影，隨后用軟件掃描灰度值分析條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用Graphpad Prism5作圖，用t檢驗(yàn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 LDL刺激使ACE活性升高

LDL處理Raw264.7 0、5、10、15min，用ACE試劑盒測(cè)定ACE的活性變化：與對(duì)照組相比，酶的活性在刺激后5min（1.3667±0.1457，P＜0.05）、15min（1.3767±0.1401，P＜0.05）增高（圖1）。

圖1.LDL刺激Raw264.7細(xì)胞0、5、10、15min后ACE的活性變化n＞3,*P＜0.05

2.2 LDL刺激使AngⅡ表達(dá)升高

LDL處理Raw264.7 0、1、3、5、7、9、12h，試劑盒測(cè)定AngⅡ的表達(dá)：與對(duì)照組（797.6±12.46），相比，刺激后AngⅡ1h（952.5±21.28，P＜0.05）、7h（969.63±20.82，P＜0.05）表達(dá)升高（圖2）。

圖2 LDL刺激細(xì)胞0、1、3、5、7、9、12h后AngⅡ的表達(dá)變化n＞3,*P＜0.05

2.3 LDL刺激Raw264.7細(xì)胞后檢測(cè)ACE mRNA的表達(dá)

LDL處理Raw264.7細(xì)胞0、1、3、5h：與對(duì)照組相比，刺激后3h ACE mRNA的表達(dá)升高（1.2533±0.1405，P＜0.05）,5h下降（0.7000±0.1100，P＜0.05）（圖3）。

圖3.LDL刺激細(xì)胞0、1、3、5h后ACE mRNA的表達(dá)變化n＞3,*P＜0.05

2.4 LDL刺激Raw264.7細(xì)胞后檢測(cè)AT2R mRNA的表達(dá)

LDL刺激Raw264.7細(xì)胞0、1、3、5h：與對(duì)照組相比，刺激1h（2.805±1.006，P＜0.05）、5h（3.6700±1.0934，P＜0.05）后AT2 mRNA表達(dá)升高（圖4）。

圖4.LDL刺激細(xì)胞0、1、3、5h后AT2RmRNA的表達(dá)變化n＞3,*P＜0.05

2.5 Western Blot檢測(cè)AT2R的表達(dá)

LDL刺激Raw264.7細(xì)胞0、1、3、5h后，檢測(cè)AT2R的表達(dá)：AT2R蛋白表達(dá)升高，3h（2.5967±0.7253，P＜0.05）、5h（2.5933±0.6886，P＜0.05）升高約2.6倍（圖5）。

圖5.LDL刺激細(xì)胞0、1、3、5h后AT2R的表達(dá)變化n＞3,*P＜0.05

3.討論

研究表明，AngⅡ參與了AS的病理生理過(guò)程，血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓會(huì)加重ApoE-小鼠中AS的發(fā)展[9]。LDL的氧化過(guò)程是一個(gè)多因子參與的過(guò)程，早期的研究已經(jīng)表明人體注射血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）后血壓的升高與血清 LDL 水平密切相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ會(huì)促進(jìn)LDL聚集[10]。因此AngⅡ和LDL之間應(yīng)該存在相互作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，在LDL刺激5-15min內(nèi)ACE的活性提高，從而使AngⅡ的含量在1h后也升高，因此LDL可以促進(jìn)AngⅡ的表達(dá)；并且ACE mRNA、AT2 mRNA與蛋白表達(dá)都升高，說(shuō)明LDL能激活RAS。因此天然LDL粘附于細(xì)胞被氧化成oLDL的過(guò)程中，血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）被激活，使AngⅡ表達(dá)升高，進(jìn)一步LDL促進(jìn)了ACE mRNA和AT2受體的表達(dá)，說(shuō)明LDL激活了腎素-血管緊張素系統(tǒng)。

我們推測(cè)天然LDL氧化過(guò)程中，AngⅡ可能作為識(shí)別標(biāo)簽，通過(guò)識(shí)別受體AT1、AT2，介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)LDL的氧化。本實(shí)驗(yàn)可作為AngⅡ與LDL相互作用的部分依據(jù)，后面會(huì)繼續(xù)研究AngⅡ作用于LDL的方式，檢測(cè)AngⅡ與LDL的相互作用方式，探究LDL氧化的分子機(jī)制。