硫酸右旋糖苷抑制人胃癌細胞增殖、遷移及相關因子表達的作用

楊媛媛 王文莙 王瀟飛 曹相玫 黃允寧 馬艷梅 徐遠義

1寧夏醫科大學基礎醫學院病理學系（銀川750004）；2寧夏回族自治區人民醫院胃腸外科（銀川750001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，也是癌癥相關死亡主要原因之一［1］。胃癌患者表現為“三低三高”的特征，即早期診斷率、根治性切除率與五年生存率低，發病率、轉移率與死亡率高。局部擴散與遠處轉移是導致胃癌治療失效與預后不良的首要原因［2］。胃癌細胞異常增殖、侵襲與遷移是胃癌擴散與轉移的關鍵步驟。因此，識別胃癌細胞在異常增殖、侵襲與遷移過程的特異性分子標志物，研發針對特定分子異常的靶向治療藥物是胃癌治療亟需解決的難題。

腹腔種植轉移是胃癌患者最常見的復發形式。本研究所采用的藥物硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）具有腹腔吸收慢、作用時間久、毒副作用少等優勢，被認為是一種具有研究潛力與研究價值的抗癌藥物［3］。前期研究已經證實DS能夠有效減少胃癌腹腔種植轉移［4］并且DS能夠抑制不同分化程度的人胃癌細胞與正常胃黏膜細胞的增殖、侵襲與遷移能力［5］。然而，涉及具體信號通路的分子機制有待進一步的研究。

最近的研究表明，轉錄因子NF-E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）與其下游靶基因血紅素氧合酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）在多種腫瘤中表達上調并且與腫瘤的增殖、侵襲與遷移過程關系密切相關［6］。目前，Nrf2/HO-1信號通路活化在胃癌發展與轉移中的作用尚未明確。因此，以Nrf2、HO-1為靶點的相關研究，對胃癌治療具有重要意義。

本研究模擬體內胃癌缺氧微環境，在低氧條件下培養人胃癌BGC-823細胞，觀察DS對細胞增殖、侵襲與遷移能力的影響，檢測DS作用前后Nrf2、HO-1的表達變化，探討DS抑制腹腔種植轉移可能的分子機制，旨在為DS的后續研究與臨床應用提供新的理論依據，也為胃癌的診斷與治療提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人胃低分化腺癌細胞株BGC-823購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司腫瘤細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑DS購自美國Sigma公司；RPMI1640培養基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自以色列BI公司；青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京索萊寶公司；兔單克隆抗體Nrf2、小鼠單克隆抗體HO-1均購自英國Abcam公司；小鼠單克隆抗體β-Tubulin購自北京康為世紀公司；FITC標記山羊抗兔IgG、羅丹明標記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋公司；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基公司；ECL化學發光試劑盒購自北京普利萊公司；Nrf2、HO-1與GAPDH引物序列由上海生工公司設計合成；總RNA提取試劑盒購自美國Omega公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與藥品處理人胃癌BGC-823細胞復蘇后使用含10%FBS與1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內培養。待細胞密度生長至80%～90%時開始傳代培養，2 d更換一次新鮮培養基，3 d進行一次傳代。于對數生長期，收集細胞備檢，進行下述實驗。稱取適量DS溶解于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中，混勻后經22 μm過濾器滅菌，使用前用培養基稀釋至終濃度為0.3%。

1.2.2 平板克隆形成實驗收集上述細胞，調整細胞密度至103個/mL，接種于60 mm培養皿中，米字方向輕輕晃動，盡量使細胞分散均勻。待細胞貼壁穩定后，于對照組與實驗組分別加入PBS與DS，24 h后更換完全培養基，隔天更換新鮮培養基，繼續培養至10 d觀察細胞生長情況。待出現肉眼可見的細胞克隆時終止培養，棄去培養基，PBS沖洗，經4%多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染色后，流水緩慢洗去染液，觀察克隆并拍照，計算各組中細胞克隆形成數量。

1.2.3 Transwell侵襲與遷移實驗稀釋基質膠鋪于小室上室。待基質膠凝固后，收集上述細胞，調整細胞密度為105個/mL，接種于小室上室。待細胞貼壁穩定后，上室更換相應的干預培養基，下室添加含FBS的常規培養基，置于37℃、1%O2、5%CO2培養箱內繼續培養24 h。輕柔擦棄上室細胞與基質膠，經4%多聚甲醛固定，1%結晶紫染色后，顯微鏡下觀察。隨機選取5個400倍視野拍照，計算各組中穿膜細胞數量。遷移實驗無需鋪膠，余同侵襲實驗制備。

1.2.4 免疫細胞熒光收集上述細胞，調整細胞密度為105個/mL，接種于細胞爬片。待細胞貼壁穩定后，于對照組與實驗組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養箱內繼續培養2、8、12、24 h。細胞爬片經4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100通透20 min，10%山羊血清封閉30 min，一抗反應4℃過夜，二抗反應37℃30 min，滴加DAPI工作液，封片。Nrf2用FITC標記，HO-1用羅丹明標記，細胞核用DAPI標記。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件，在400倍鏡下隨機選取5個視野，獲得所選視野的平均光密度值。

1.2.5 Western Blot收集上述細胞，接種于60 mm培養皿中，數量為2×106個細胞/皿。待細胞貼壁穩定后，于對照組與實驗組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養箱內繼續培養2、8、12、24 h。應用全蛋白提取試劑盒收集不同時間點的細胞蛋白裂解液，劇烈震蕩30 s，冰上孵育4 min，重復5個循環，14 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液為全蛋白提取物。應用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。100℃加熱10 min。配膠、上樣、進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗反應、二抗反應、ECL顯影。應用Image J圖像分析軟件測量條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.2.6 Q-PCR收集上述細胞，接種于60 mm培養皿中，數量為2×106個細胞/皿。待細胞貼壁穩定后，于對照組與實驗組分別加入PBS與DS，置于37 ℃、1%O2、5%CO2培養箱內繼續培養2、8、12、24 h。應用總RNA提取試劑盒收集不同時間點的細胞RNA裂解液，應用逆轉錄試劑盒以RNA為模板合成cDNA，應用熒光定量PCR試劑盒進行PCR反應。Nrf2引物，F：5′-AACACAAGTCCCAGTGTGGC-3′，R：5′-TGCCCCTGAGATGGTGACAA-3′，擴增片段為194 bp。HO-1引物，F：5′-GGCCTCCCTGTACCACATCT-3′，R：5′-CTGCATGGCTGGTGTGTAGG-3′，擴增片段為 184 bp。GAPDH引物，F：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，R：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，擴增片段為138 bp。以GAPDH為內參基因，采用2-△CT方法計算對照組與實驗組中目的基因mRNA相對表達量。

1.3 統計學方法應用IBM SPSS23.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 平板克隆形成實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞增殖能力的影響采用平板克隆形成實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞增殖能力的影響。平板克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組細胞克隆形成數量明顯減少，并且形成的克隆體積較小、染色較淺，差異具有顯著性（P＜0.01，圖1）。結果表明，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖能力。

2.2 Transwell遷移實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞遷移能力的影響采用Transwell遷移實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞遷移能力的影響。Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組遷移的細胞數量明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2C），結果表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞的遷移能力。

2.3 Transwell侵襲實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響采用Transwell侵襲實驗檢測DS對人胃癌BGC-823細胞侵襲能力的影響。Transwell侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組穿過基底膜的細胞數量明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2D），結果表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞的侵襲能力。

2.4 免疫細胞熒光檢測DS對人胃癌BGC-823細胞Nrf2、HO-1表達的影響采用免疫熒光雙染分別標記Nrf2與HO-1。結果顯示，Nrf2的表達主要分布于細胞質與細胞核，實驗組比對照組熒光強度明顯減弱，2、8、12、24 h差異均有統計學意義（P2＜ 0.01、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖3B）。HO-1的表達主要分布于細胞質與細胞核，實驗組比對照組熒光強度明顯減弱，2、8、12、24 h差異均有統計學意義（P2＜ 0.05、P8＜ 0.01、P12＜0.01、P24＜0.01，圖3C）。同時可觀察到Nrf2與HO-1存在共定位現象，共定位集中于細胞質與細胞核。并且，隨著低氧培養時間的延長，Nrf2、HO-1的熒光強度逐漸增加。

2.5 Western Blot檢測DS對人胃癌BGC-823 細胞Nrf2、HO-1表達的影響采用Western Blot檢測對照組與實驗組在低氧條件下培養2、8、12、24 h后人胃癌BGC-823細胞中Nrf2、HO-1的蛋白表達水平。結果顯示，Nrf2的蛋白表達量隨低氧時間的延長呈現上升趨勢，尤其以12、24 h增加最為顯著。同一時間點實驗組與對照組相比表達量明顯降低，差異有統計學意義（P2＜ 0.05、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖4B）。HO-1的表達量隨低氧培養時間的延長而逐漸增加，實驗組與對照組相比表達量在2 h差異無統計學意義（P2＞0.05），在8、12、24 h顯著降低，差異有統計學意義（P8＜0.05、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖4C）。結果表明，Nrf2、HO-1的蛋白表達水平隨低氧時間延長而逐漸增加，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞中Nrf2、HO-1的表達。

圖2 Transwell遷移與侵襲實驗檢測對照組與實驗組人胃癌BGC-823細胞遷移和侵襲能力Fig.2 Transwell invasion and migration assay were used to detect the invasive ability and migration ability of human gastric cancer BGC-823 cells in the control group and the experimental group，respectively

圖3 免疫細胞熒光檢測對照組與實驗組不同時間點Nrf2、HO-1的蛋白表達Fig.3 Immunofluorescence assay was used to detect the protein expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

圖4 Western Blot檢測對照組與實驗組不同時間點Nrf2、HO-1的蛋白表達Fig.4 Western Blot assay was used to detect the protein expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

2.6 Q-PCR檢測DS對人胃癌BGC-823細胞Nrf2、HO-1表達的影響采用Q-PCR檢測對照組與實驗組在低氧條件下培養2、8、12、24 h后人胃癌BGC-823細胞中Nrf2、HO-1的mRNA表達水平。結果顯示，Nrf2的mRNA表達量隨低氧培養時間延長而逐漸增加。與對照組相比，實驗組mRNA表達量明顯降低，4個時間點差異存在顯著性（P2＜ 0.01、P8＜ 0.01、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖5A）。HO-1的表達量隨低氧培養時間的延長而逐漸增加，實驗組與對照組相比表達量在2 h略有減少（P2＞ 0.05），在8、12、24 h明顯減少，差異存在顯著性（P8＜ 0.05、P12＜ 0.01、P24＜ 0.01，圖5B）。

圖5 Q-PCR檢測對照組與實驗組不同時間點Nrf2、HO-1的mRNA表達Fig.5 Q-PCR assay was used to detect the mRNA expression of Nrf2 and HO-1 at different time points in the control group and the experimental group

3 討論

早期胃癌的治療多以外科手術為主，手術后輔以化學藥物治療，而對進展期或中晚期的胃癌以化學藥物治療為主［7］。普通的化療藥物在腹腔容易被吸收，導致藥物在腹腔停留時間過短不能達到很好的治療作用。本研究中采用的DS屬于大分子右旋糖苷衍生物，相對分子質量為5×105，正因其分子量較大使之在腹腔吸收緩慢，作用時間相對延長，腹腔腫瘤細胞持續暴露于高濃度藥物中而大大提升化療效果。

課題組前期通過體內研究證實，DS能夠減少裸鼠腹腔種植轉移瘤的數量、體積與瘤內血管生成［4］；體外研究證實DS能夠抑制不同分化程度的人胃癌細胞株AGS、BGC-823、MGC-803、SGC-7901和正常胃黏膜細胞株GES-1的增殖、侵襲與遷移［5］。基于前期研究基礎筆者推測DS能夠通過改善腫瘤內微環境、減少腫瘤血管生成、降低腫瘤細胞生物活性等方面抑制胃癌腹腔種植轉移，然而具體的分子機制尚不明確。微環境是一個功能單元，能夠與腫瘤細胞進行復雜和動態的相互作用［8］。由于腫瘤的快速生長和相關的血管功能不全導致腫瘤細胞的O2供應與消耗速率之間不平衡。缺氧是胃癌微環境的一個重要病理生理特征［9］。本研究旨在胃癌缺氧微環境下探討DS對人胃癌細胞BGC-823細胞增殖、侵襲與遷移的作用及其可能的分子機制。

胃癌細胞具有活躍的增殖、侵襲與遷移能力，這種能力使胃癌早期即可發生轉移。胃癌患者多處于進展期往往已存在局部轉移甚至遠處轉移。本研究為了觀察DS對人胃癌BGC-823細胞增殖能力的影響，首先采用平板克隆形成實驗檢測DS干預前后細胞增殖能力的變化，結果顯示，DS干預后細胞克隆形成數量顯著減少，說明DS能夠顯著抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖能力。隨后，為了觀察DS對人胃癌BGC-823細胞侵襲與遷移能力的影響，筆者又采用Transwell侵襲實驗與Transwell遷移實驗分別檢測DS對人胃癌BGC-823細胞侵襲能力與遷移能力的影響。侵襲與遷移實驗的結果一致，DS干預后穿膜細胞數量明顯減少，表明DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞的侵襲能力與遷移能力。以上結果表明，DS能夠有效抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖、侵襲與遷移。

腫瘤細胞增殖、侵襲與遷移是一個動態連續的復雜過程，受多個分子通路及其之間復雜的交互作用所調控。Nrf2是堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子Cap‘n′Coall（CNC）家族的成員，主要參與激活與細胞適應以及細胞保護相關的基因表達。通常Nrf2以無活性狀態位于細胞質中，因與細胞質中的伴侶蛋白Keap1結合活性受到抑制。一旦細胞處于氧化應激反應，Keap1就會從Nrf2中解離，失去抑制Nrf2活性的能力。此時Nrf2易位進入細胞核，與抗氧化反應元件ARE結合，從而激活各種細胞保護蛋白基因的表達，其中以HO-1表達水平的提高最為明顯［10］。HO-1是Nrf2的依賴性細胞反應的主要效應物之一［11］。HO-1是血紅素分解代謝過程中的起始酶與限速酶，它能夠催化血紅素降解產生膽紅素、一氧化碳（CO）和游離鐵（Fe2+），這些物質具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用［12］。

Nrf2與HO-1所形成的Nrf2/HO-1信號通路，被認為是細胞內最重要的內源性抗氧化應激保護機制［13］。正常生理狀態下，Nrf2/HO-1信號通路的激活有利于細胞內穩態的維持與細胞應激反應的適應性。然而，越來越多的證據表明Nrf2與其轉錄的靶基因的潛在致癌作用。Nrf2、HO-1被發現在多種腫瘤表達上調，并且與腫瘤的發生發展有關［6］。進一步的研究表明，Nrf2、HO-1在腫瘤細胞增殖中起關鍵作用。Nrf2的高表達誘導人膠質母細胞瘤細胞的生長與增殖，反之Nrf2的敲低抑制人膠質母細胞瘤細胞的生長與增殖。并且Nrf2通過下調HO-1抑制癌細胞的生長與增殖［14］。人結腸癌細胞中Nrf2敲低抑制了異種移植物中的腫瘤生長［15］。HO-1的過表達增加了小鼠黑色素瘤細胞的活力與增殖，并降低了荷瘤小鼠的存活率［16］。

Nrf2、HO-1不僅參與細胞增殖，而且還參與細胞侵襲與遷移。Nrf2可促進腫瘤微環境的重塑，使其有利于癌細胞的自主入侵和遷移［17］。Nrf2還可通過氧化應激相關分子調節腫瘤細胞的侵襲和遷移。在膠質母細胞瘤中Nrf2表達的下調能夠減少細胞的侵襲與遷移［18］。HO-1的高表達增加了非小細胞肺癌細胞的侵襲與遷移［19］。此外，Nrf2及其靶蛋白HO-1參與人微血管內皮細胞的細胞遷移［20］。目前，Nrf2/HO-1信號通路活化與胃癌生長、轉移的相關研究很少，其在胃癌發生發展過程中所起的作用尚不明確。因此，Nrf2、HO-1可能是胃癌診斷與治療的潛在分子標志物。

本研究在低氧條件下培養人胃癌BGC-823細胞不同時間后，采用免疫細胞熒光、Western Blot檢測DS干預前后Nrf2、HO-1蛋白表達水平。結果顯示，不同時間點Nrf2、HO-1的表達量隨低氧時間的延長呈現上升趨勢，尤其以12、24h增加最為顯著。提示低氧能夠誘導Nrf2、HO-1高表達，并且這種表達具有時間依賴性。Nrf2、HO-1的表達水平與低氧培養時間呈正相關，反映胃癌缺氧微環境能夠促進Nrf2、HO-1的表達，提示Nrf2、HO-1與胃癌的發生發展關系密切。Nrf2、HO-1在胃癌中表達上調這與Nrf2、HO-1被證實在其他不同類型腫瘤中表達上調［6］結果一致。與此同時，同一時間點實驗組與對照組相比表達量降低，表明DS可以持續作用并顯著抑制Nrf2、HO-1的表達。Nrf2、HO-1表達趨勢的變化幾乎是同步的，提示Nrf2對HO-1表達的重要調節作用。因此，筆者推測DS可能直接作用于Nrf2，通過抑制Nrf2依賴性HO-1表達，從而抑制胃癌增殖、侵襲與遷移。為了進一步明確DS作用的分子機制，筆者采用Q-PCR實驗檢測相同條件下人胃癌BGC-823細胞中Nrf2、HO-1的mRNA表達水平。結果與免疫細胞熒光、Western Blot檢測結果一致。以上結果表明，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖、侵襲與遷移，其機制可能是DS通過作用于Nrf2進而對HO-1的表達產生影響來實現的。然而，本研究結果不能完全排除DS作用于Nrf2/HO-1信號通路上游靶點或者其他信號通路影響人胃癌BGC-823細胞增殖、侵襲與遷移的可能。后續研究將構建Nrf2基因過表達或沉默載體繼續深入探討DS對Nrf2/HO-1信號通路的調控作用與作用效果。

綜上所述，DS能夠抑制人胃癌BGC-823細胞增殖、侵襲與遷移的能力，并下調Nrf2、HO-1的表達。本研究有望為DS的后續研究與臨床應用提供新的理論依據，也為胃癌的診斷與治療提供新的分子靶點。