Fmoc-苯丙氨酸水凝膠及其復配EGCG抑菌作用研究

付成，袁發滸，胡蕓瑕，高連君，魏棟玉，陳春蘭

（1.江漢大學交叉學科研究院，湖北 武漢 430056；2.江漢大學醫學院，湖北 武漢 430056）

隨著人們生活品質的提升，食品安全問題已成為現今社會的熱點議題，其中食品微生物危害是食品衛生中的重要部分，而隨著食品種類、樣式的不斷豐富和發展，尤其是各式各樣零食及冷飲食品的出現[1]，使得相關產品對抑菌的要求也越來越高。目前，在食品安全方面的抑菌材料也非常多，比如苯甲酸鹽類、山梨酸鹽類、對羥基苯甲酸等有機化學防腐劑，此類防腐劑雖然效果不錯，但是目前食品安全發展的趨勢之一就是向著天然產物的方向發展[2]，比如具有抑菌效果的多肽、多糖等。多肽在食品安全方面已經有廣泛的應用，目前食品安全方面研發的多肽材料中，抑菌肽是一類重要的小分子[3-4]。與抗生素相比，抑菌肽具有高效、無殘留、不易產生耐藥性等優勢[3]。抑菌肽根據來源、分子結構或者應用對象的不同，可以分為很多類，其中抑菌肽形成的水凝膠就是一種具有抑制細菌生長能力的自組裝結構[5-7]。宋濤等[8]合成一種分子結構為兩親嵌段的共聚物，即聚己內酯-聚谷氨酸，它可以形成囊泡。在囊泡上面沉積納米銀，再把抑菌囊泡與普朗尼克F127 混合形成水凝膠，而形成的水凝膠則用于抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。除了共聚物外，石璐[9]利用半胱氨酸和銀納米簇絡合作用形成的水凝膠殺滅砧板上雜菌，殺滅數值為1.25，滿足國標中殺滅對數值1.0 的要求。

芴甲氧羰基-苯丙氨酸（N-[（9H-fluoren-9-ylmethoxy）carbonyl]-3-phenylalanine，Fmoc-Phe）是一種氨基酸衍生物的超分子水凝膠因子，研究顯示在弱堿性緩沖液中可以形成水凝膠，并與石墨烯[10]、碳納米管[11]、原位合成納米銀[12]形成雜化水凝膠材料，也可以包覆水楊酸用于抑制金黃色葡萄球菌的生長[13]，包覆并控制釋放丁香精油[14]。相較聚合水凝膠而言，它具有小分子容易滲透的優勢，而且該分子來源簡單，價格便宜，生物相容性很好。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是一種目前廣泛研究的天然抗氧化劑[15]，它具有很強的抗氧化性，還具有抗炎、抗病毒等方面的作用[16-17]。在食品工業領域，EGCG 被廣泛應用于食品保鮮、防腐等方面的基礎研究及實際生產，表明EGCG 是一種可應用于食品領域的天然的新型廣譜抑菌成分[18-21]。

為了研究構型對抑菌性的影響，本文利用具有對映異構體的D 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-DPhe）和L 型Fmoc-苯丙氨酸（Fmoc-LPhe）作為凝膠因子，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液制備水凝膠并用于測試其對抑制金黃色葡萄球菌生長的效果，并初步探討二者的抑菌性性能差異及抑菌機理。此外，為了提高水凝膠的抑菌效果，本文將EGCG 復配到Fmoc-苯丙氨酸制備的水凝膠中，研究含有EGCG 的超分子水凝膠的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fmoc-苯丙氨酸（L/D 型）、苯丙氨酸（L/D 型）、Fmoc-甘氨酸（L 型）、Fmoc-酪氨酸（L 型）：上海吉爾生化有限公司；磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉：分析純，國藥集團；EGCG：杭州普麗美地生物科技有限公司；細菌培養營養瓊脂：青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋（HH420）：金壇市科析儀器有限公司；旋渦混勻器（Vortex3）：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；電子分析天平（ME414S）：德國 Sartorius；紫外可見分光光度計（LAMBDA 25）、分子熒光光譜儀（LS55）：美國 PerkinElmer；圓二色譜儀（J1500）：日本 JASCO；高分辨場發射掃描電子顯微鏡（HITACHI SU8000）：日本HITACHI。

1.3 方法

1.3.1 Fmoc-Phe 水凝膠的制備

準確稱取12 mg 的Fmoc-Phe，加入1 mL pH 7.4的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，旋渦振蕩5 min，80 ℃水浴加熱15 min，冷卻后即可形成澄清透明的凝膠。

1.3.2 紫外可見吸收光譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的溶液加入到石英比色皿中。LAMBDA 25 型紫外可見分光光度計掃描200 nm～700 nm 波長的吸收曲線。

1.3.3 熒光光譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的熱溶液加入到石英比色皿中，冷卻形成水凝膠。穩態熒光光譜在LS55 型熒光分光光度計上進行，激發光波長265 nm，發射波長325 nm，狹縫寬度5。

1.3.4 圓二色譜表征

制備濃度為12 mg/mL 的Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe超分子水凝膠，分別將含Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 的熱溶液加入到石英比色皿中，冷卻形成水凝膠。采用J1500 型圓二色譜儀（CD）測試250 nm～400 nm 的CD信號。

1.3.5 場發射掃描電子顯微鏡微觀結構觀察

將凝膠樣品的熱溶液滴加少許于先劃好的直徑低于5 mm 的玻璃片，待凝膠形成后，將玻璃片在液氮中冷凍10 min，將凍干的玻璃片放入冷凍干燥機中凍干。凍干的玻璃片放入日立高分辨場發射掃描電子顯微鏡中測試其微觀結構。

1.3.6 抑菌性評價試驗

在超凈工作臺內，制備細菌營養瓊脂平板（1.5%），挑取金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CGMCC1.282），密集劃線法或涂布法接種于瓊脂平板，而后取內徑6 mm 的無菌打孔器，對稱的在瓊脂上，挖取加樣孔，分別注入未冷卻（約55 ℃）Fmoc-氨基酸凝膠液或100 μL 無菌磷酸鹽緩沖液。待凝膠形成后，將檢測平板置于電熱培養箱中37 ℃培養24 h 而后量取抑菌圈直徑。

為進一步探討Fmoc-Phe 水凝膠與EGCG 復配的抑菌效果，將Fmoc-DPhe 充分溶解，溶解之后加入EGCG 溶液，確保EGCG 的最終濃度在5 mg/mL。制備金黃色葡萄球菌懸液，并以10 倍梯度稀釋選擇合適的菌液濃度用于抑菌試驗。將制備好Fmoc-DPhe 凝膠、含EGCG 的Fmoc-DPhe 凝膠及EGCG 溶液分別置于菌懸液中作用一段時間，吸取0.5 mL 上述混合均勻的菌懸液接種于無菌平板上，37 ℃培養24 h 后計數。

2 結果與分析

2.1 水凝膠物理化學表征

Fmoc-Phe 是一種高效的凝膠因子，具有很強的自組裝能力，它通過苯環間π-π 堆積、范德華力等非共價相互作用自組裝形成三維網絡結構的聚集體，是一種常見的用于多肽合成的氨基酸衍生物，它具有L型（Fmoc-LPhe）和D型（Fmoc-DPhe）兩種鏡像對映異構體。為了研究對映異構體分子對抑菌效果的影響，分別制備了兩種構象的超分子水凝膠，通過紫外可見光吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜等進行化學表征。

紫外-可見光吸收曲線見圖1。

圖1 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的紫外吸收光譜曲線Fig1 The absorption spectrum curve of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

紫外-可見光吸收曲線（圖1）顯示，Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 在200 nm～300 nm 區域有紫外吸收，但是二者的吸收曲線沒有明顯的區別。

分子熒光光譜圖見圖2。

分子熒光光譜（圖2）結果顯示，在265 nm 的激發波長下，Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 水凝膠均在325 nm處有最強的熒光信號。

圓二色光譜圖見圖3。

圓二色光譜圖信號顯示（圖3），兩種對映異構體形成的水凝膠，其信號的強度一致，但是方向是相反的，因此該水凝膠是具有對映異構體的鏡像對稱性質。

圖2 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的熒光光譜曲線。Fig.2 The fluorescence spectra of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

圖3 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的圓二色光譜圖Fig.3 The circular dichromatic spectrum of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

Fmoc-DPhe 和Fmoc-LPhe 自組裝形成的水凝膠外觀上都是澄清透明。場發射掃描電鏡的微觀結構見圖4。

圖4 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠的場發射掃描電鏡圖像Fig.4 Field emission scanning electron microscopy images of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel，respectively

場發射掃描電鏡的微觀結構（圖4A 和圖4B）顯示，雖然兩種水凝膠的CD 信號方向對稱相反，但是超分子水凝膠自組裝結構的微觀結構并沒有明顯的區別。

2.2 Fmoc-Phe水凝膠抑菌效果觀察

水凝膠抑菌效果見圖5。

如圖5所示，濃度為12 mg/mL 的兩種不同構象的Fmoc-Phe 水凝膠均對金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用，且D 型的Fmoc-Phe 水凝膠抑菌性要強于L 型（P＜0.01）。

圖5 Fmoc-DPhe和Fmoc-LPhe水凝膠對金黃色葡萄球菌的抑作用Fig.5 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LPhe gel

2.3 Fmoc-DPhe與EGCG復配水凝膠抑菌效果研究

EGCG 是近年來廣泛研究的植物活性成分，因其較好的抗氧化、抑菌性能，被認為是一種可應用于食品領域的新型抑菌劑。本研究探討了Fmoc-DPhe 水凝膠與EGCG 復配的抑菌性能。12 mg/mL 的Fmoc-DPhe與5 mg/mL 的EGCG 復配的水凝膠抑菌能力顯著高于單獨使用其中一種（見圖6）。

圖6 Fmoc-DPhe水凝膠與EGCG復配對金黃色葡萄球菌的抑制作用Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by Fmoc-DPhe hydrogel in combination with EGCG

2.4 Fmoc-氨基酸水凝膠抑菌機理初探

為探究Fmoc-氨基酸水凝膠抑菌機理，本研究分別測試了光學構象以及Fmoc 基團對抑菌作用的影響，結果見圖7。

圖7 Fmoc基團及光學構象Fmoc-氨基酸凝膠對金黃色葡萄球菌的抑制作用的影響Fig.7 Effect of Fmoc group and optical conformation to Fmocamino acid gel on inhibition of Staphylococcus Aureus

發現在濃度、pH 值一致時，無光學異構特征的Fmoc-甘氨酸比兩種構型的Fmoc-苯丙氨酸的抑菌性能弱的很多。同時，將兩種不同光學構型的苯丙氨酸分子與其對應的Fmoc-苯丙氨酸分子對比，發現苯丙氨酸對映異構體對金黃色葡萄球菌的生長均沒有抑制作用。

進一步的，為驗證氨基酸中的苯環結構是否與Fmoc 基團協同作用從而產生抑菌性能，將Fmoc-LTyr與Fmoc-DPhe 形成的凝膠作對比，可見兩種含苯環的氨基酸經Fmoc 修飾后均可表現出對金黃色葡萄球菌的抑制做用（見圖8）。

圖8 Fmoc-DPhe凝膠與Fmoc-LTyr凝膠對金黃色葡萄球菌的抑制作用對比Fig.8 The inhibition effect of Fmoc-DPhe gel and Fmoc-LTyr gel on Staphylococcus Aureus was compared

3 結論

系統對比了經Fmoc 基團修飾后不同光學構象的苯丙氨酸制備的超分子水凝膠的物理特征，發現除光學構象不同外，其他物理性質基本無差異。進一步對兩種構象的Fmoc-Phe 的抑菌作用對比發現，非天然的D 型Fmoc-Phe 抑菌作用優于L 型Fmoc-Phe。

通過將天然抑菌分子EGCG 與Fmoc-Phe 凝膠復配，可以發現二者具有協同增效抑菌。這為Fmoc-Phe在食品安全領域的應用提供了新的思路。同時，本研究還進一步的對Fmoc 基團修飾氨基酸產生的抑菌作用機制做了探討，發現Fmoc 修飾的氨基酸的抑菌能力是由苯環母體經Fmoc 基團修飾后產生的，這為后續其他Fmoc 氨基酸水凝膠的開發提供了方向。