枸杞發酵液抗氧化和免疫調節作用研究

張瑞雪，崔欣悅，馬勇，劉金虎，張子韜，谷瑞增，魏穎，*

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015；3.寧夏光彩生物科技有限公司，寧夏 銀川 750004）

枸杞（Lycium chinense Mill）為茄科枸杞屬（Lycium Linn.）植物，其果實是一種“藥食同源”的功能保健性食品，也是一味常用的補肝益腎中藥，其色鮮紅，味酸甜[1]。枸杞在地球上約80 多種，在我國有7個種3個變種，主要分布于我國北部地區[2]，尤其寧夏枸杞在我國寧夏地區已形成大規模種植。

現代科學研究發現枸杞中化學成分類型多樣[3]，主要涉及生物堿類、黃酮類、萜類等化合物，此外，多糖及類胡蘿卜素衍生物也是枸杞中常見的成分。現代藥理研究發現枸杞具有多種活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎、肝保護、神經保護、抗微生物及輻射保護活性等。近年來，隨著人們對養生保健的重視，枸杞加工的研究越來越深入。傳統枸杞產品，如枸杞汁、枸杞醋和枸杞酒的工藝逐漸改進；枸杞多糖、黃酮和籽油提取產品，枸杞干制品和枸杞復合產品開發已成為枸杞加工業研究的熱點。

枸杞是著名的防衰老滋補品[4]，被列為首選的延緩衰老食品之一[5]，許多養生方劑中都有枸杞。目前，枸杞功能活性方面，較側重于提取物和多糖，對枸杞全果的利用研究鮮有報道。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是存在于人類和動物體內的天然有益腸道菌群，果蔬經過乳酸菌發酵后，能夠延長果蔬的保質期，改善新鮮蔬菜的感官特性，并且產生多種功能性物質[6-7]，如超氧化物歧化酶、還原性谷胱甘肽、阿魏酸等，提升其營養價值和功能活性。本文選用經乳酸菌發酵后的枸杞全果發酵液，以細胞模型為基礎，研究其抗氧化活性和免疫調節活性，為枸杞的功能評價、合理開發利用奠定實驗基礎并提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞發酵液原液（1 號～3 號）：寧夏光彩生物科技有限公司（1 號）、臺灣大漢酵素有限公司（2 號）、日本萬田酵素有限公司（3 號）；小鼠（Balb/c，6 周齡～8 周齡）：北京維通利華實驗動物技術有限公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽[2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、2’，7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）：sigma 公司；RPMI-1640 培養基：Hyclon 公司；胎牛血清：杭州四季青公司；胰蛋白酶和中性紅：Amresco 公司；臺盼藍、紅細胞裂解液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、NO 試劑盒、CCK-8 試劑盒：碧云天生物技術研究所；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：現用現配，裝瓶滅菌后待用。

1.2 儀器與設備

Spectra MR 多功能酶標儀：美國dynex；AC2-6S1生物安全柜：新加坡藝思高科技有限公司；HF90 CO2培養箱：上海力申科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞發酵液清除自由基的影響

1.3.1.1 樣品處理

樣品處理前，單細胞懸液以1.0×105個/mL 接于6孔板，每孔2 mL 細胞懸液。待24 h 后細胞單層貼壁，樣品溶于熒光染料處理細胞（2 mL/孔），同時設空白對照組和AAPH 組，每組設置6個平行樣本。培養箱37 ℃繼續孵育1 h 后，吸棄含有樣品的培養液，用PBS 緩沖液清洗細胞兩次，除空白對照組外，每孔加入800 μmol/L AAPH，繼續培養 30 min，MTT 法測定OD 值，計算細胞相對存活率。

1.3.1.2 活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）測定

以1.0×105個/mL 細胞密度接種 96 孔細胞培養板，每孔 2 mL，放置 37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h。隨后小心吸走6 孔中的細胞上清液，用PBS 清洗一次。加入無血清的RPMI-1640 培養基稀釋的枸杞發酵液和熒光染料DCFH-DA，終濃度為25 μmol/L 2 mL，于 37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養 30 min，然后取出吸走上清液，用PBS 小心清洗3 次。最后加入抗氧損傷劑AAPH，置于流式細胞儀測定相對熒光值。細胞內抗氧化能力以ROS 相對產生率來表示。

1.3.2 枸杞發酵液對T/B 淋巴細胞增殖的影響

1.3.2.1 小鼠脾細胞懸液的制備

將小鼠（Balb/c）拉頸處死，于75 %乙醇中浸泡5 min 進行消毒處理，無菌分離完整脾臟，用PBS 沖去浮血，剝除結締組織及脂肪成分。注射器吸取約5 mL PBS，輕輕插入脾內吹出細胞，重復操作數次至脾外膜透明，剩余脾組織剪成大小1 mm3小塊，剪碎后置于小燒杯上的200 目不銹鋼濾網上，用注射器針芯研磨，PBS 液洗滌，收集沖洗液至離心管，1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，加入3 mL 紅細胞裂解液，靜置2 min，加入 10 mL PBS 終止反應，離心（1 200 r/min，5 min）棄上清，用 PBS 液洗兩次，離心（1 200 r/min，5 min），用RPMI-1640 不完全培養基洗一次，離心（1 200 r/min，5 min），棄上清。加適量RPMI-1640 完全培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素和10 mmol/L Hepes）。調整細胞濃度至 2×106個細胞/mL，臺盼蘭染色檢測細胞存活率大于95%。

1.3.2.2 枸杞發酵液對脾淋巴細胞增殖的影響

將脾細胞懸液（2×106個細胞/mL）按 100 μL/孔加入到96 孔培養板中，再添加10 μL ConA/LPS（終濃度為 5 μg/mL）和不添加 ConA，10 μL 樣品溶液，設置對照組、模型組和樣品組，每組做6 次重復，將培養板置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養72 h。

選用CCK-8 試劑盒反應樣品對脾細胞和淋巴細胞增殖能力，在490 nm 測定吸光值，結果分別用增殖率和刺激指數（SI）表示，計算如下：

1.3.3 枸杞發酵液對小鼠腹腔巨噬細胞的影響

1.3.3.1 小鼠腹腔巨噬細胞的制備

Balb/c 小鼠，于實驗前3 d 腹腔注射1.5 mL4%肉湯淀粉溶液。拉頸處死小鼠，于無菌工作臺上將其腹部皮膚剝離，用一次性注射器向腹腔內注入RPMI-1640 不完全培養液 4 mL，輕柔腹部 2 min～3 min，用一次性注射器取其腹部液體，反復2 次～3 次。1 200 r/min離心8 min 收集細胞，洗滌2 次，在倒置顯微鏡下進行細胞計數，用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養液調整細胞密度達1×106個/mL，加入96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，將細胞培養板放入37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養2.5 h，吸棄上清，用預溫培養基洗去未貼壁細胞，再加入含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640 培養液，制備96 孔板巨噬細胞單層。

1.3.3.2 枸杞發酵液對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的測定

模型組每孔加入 10 μLLPS（濃度 30 μg/mL），實驗組加入LPS 與不同濃度的枸杞發酵液各10 μL/孔，每組各設6個復孔，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養。

培養24 h 后，用預溫的無血清培養液洗滌細胞3次，每孔加入200 μL 預溫的0.1 %中性紅溶液，于37 ℃，5%CO2培養箱內繼續培養1 h；傾去上清液，用預溫RPMI-1640 培養液清洗3 遍，洗去未被吞噬的中性紅；每孔加入200 μL 細胞溶解液（乙酸∶50%乙醇=1∶100，體積比），25 ℃下放置 2 h ～3 h，待細胞溶解后，用酶標儀測定OD550值。吞噬指數（pinocytosis index，PI）計算如下：

1.3.3.3 枸杞發酵液對巨噬細胞NO 生成量的影響

小鼠腹腔巨噬細胞經樣品24 h 干預后，收集上清液，依據NO 試劑盒說明書測定NO 生成量。

1.3.4 統計學處理

采用SPSS17.0 統計軟件對數據進行處理，實驗結果以均值±標準偏差（Mean±SD）表示，并采用組間t 檢驗，P ＜ 0.05 具有顯著性差異。

2 結果與分析

細胞內短時間ROS 水平的波動對于調節細胞功能具有重要的作用，但是如果細胞暴露在高劑量的或是持續性的ROS 中的時候，ROS 防御體系的能力不足以去應對機體內產生的ROS，此時ROS 動態平衡狀態被打破，即會導致氧化應激狀態的形成。大量存在的非生理水平的ROS 除了擾亂細胞正常的信號通路外，還會和多種細胞結構成份包括DNA、蛋白質、脂類在內的生物大分子發生反應，對機體產生一系列損害以致引發疾病[8]。

枸杞發酵汁處理HepG2 細胞后ROS 的測定結果見圖1。

圖1 枸杞發酵液緩解HepG2氧化應激的作用Fig.1 The oxidative stress effect of Lycium chinense Mill fermentation liquid on HepG2 cells

由圖1可知，在稀釋倍數為102時，1 號枸杞發酵液顯著（P＜0.01）提升細胞對抗氧化應激狀態的能力，ROS 相對產生率最低，為0.61，同時ROS 相對產生率與稀釋倍數呈U-型量效關系。2 號枸杞發酵液作用HepG2 細胞時，其降低細胞氧化應激狀態的能力減弱。由圖1可知，3 號枸杞發酵液作用效果優于2 號，在稀釋倍數為102，ROS 相對產生率為0.67，具有極顯著（P＜0.01）抗氧化能力，但作用能力比1 號枸杞發酵液弱。

圖2為小鼠脾細胞在不同濃度枸杞發酵液干預72 h 后，細胞增殖情況。

圖2 枸杞發酵液對小鼠脾細胞增殖的影響Fig.2 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of mice splenocytes

從圖2可以看出，枸杞發酵液7個作用濃度均可明顯刺激小鼠脾細胞增殖，對靜止的淋巴細胞具有明顯的促進作用，存在一定的絲裂原作用。在稀釋倍數為 102時，1 號枸杞發酵液顯著（P＜0.01）促進脾細胞增殖，增殖率最大，為 1.58，明顯高于 2 號（1.38）和 3 號枸杞發酵液（1.37），同時脾細胞增殖能力與作用濃度呈倒U-型量效關系。

脾細胞在有絲分裂原如ConA、LPS 等的刺激下，其形態和代謝會發生一系列的改變，轉化為母細胞并分化增殖。其中ConA 刺激T 細胞增殖，LPS 刺激B 細胞增殖。因此根據非特異性促有絲分裂原激活T 和B細胞增殖反應的程度，可推測T 和B 細胞識別特異性抗原增殖反應。圖3和圖4分別為T 淋巴細胞和B 淋巴細胞在不同濃度枸杞發酵液干預72 h 后細胞增殖情況。

圖3 枸杞發酵液對Con A誘導的T淋巴細胞增殖的影響Fig.3 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of T lymphocytes induced by Con A

圖4 枸杞發酵液對LPS誘導的B淋巴細胞增殖的影響Fig.4 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on the proliferation of B lymphocytes induced by LPS

由圖3得出：與模型組相比，在稀釋倍數為2、10和102濃度作用下，1 號枸杞發酵液對ConA 誘導的T淋巴細胞增殖具有顯著（P＜0.01）促進作用，在稀釋倍數為102濃度時，SI 值高達1.3，而2 號枸杞發酵液只在稀釋倍數為102濃度時有明顯（P＜0.01）促進作用。3號枸杞發酵液在稀釋倍數較大時有促進T 淋巴細胞增值的作用。

由圖4得出：3 種枸杞發酵液對促進LPS 誘導的B 淋巴細胞增殖作用效果不明顯，在稀釋倍數為10、102和 103濃度作用下，1 號發酵液具有明顯（P＜0.01）促進增殖作用，其他兩種發酵液在所有濃度下幾乎沒有顯著促進B 淋巴細胞增殖作用。

巨噬細胞攝入大分子和顆粒狀或細胞狀物質時主要通過胞吞作用來完成。胞吞作用即指細胞膜接觸大分子或顆粒狀物質后，即將其包圍形成小泡并吞入細胞內的轉運過程。選用吞噬中性紅能力來評價枸杞發酵液對巨噬細胞的吞噬能力的影響。枸杞發酵液對LPS 誘導的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響見圖5。

圖5 枸杞發酵液對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響Fig.5 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on neutral red pinocytosis by LPS-stimulated mice peritoneal macrophages

在LPS 的刺激下，1 號枸杞發酵液稀釋倍數為102時，對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力具有顯著（P＜0.01）促進作用，可以促進巨噬細胞吞入較大的固體或分子復合物，同時吞噬能力和濃度呈倒-U 型量效關系。2 號枸杞發酵液稀釋倍數為10 時、3 號枸杞發酵液在稀釋倍數為103時對巨噬細胞吞噬中性紅能力具有顯著（P＜0.01）促進作用。

激活的巨噬細胞利用L-精氨酸合成NO，增加巨噬細胞的細胞毒性，發揮非特異性殺菌和殺傷腫瘤細胞的作用，以及通過多條途徑引起免疫聯鎖反應[9]。因此，NO 合成是巨噬細胞被激活的重要標志，可以使巨噬細胞發揮非特異性免疫作用，并參與炎癥反應和免疫反應[10]。枸杞發酵液對小鼠腹腔巨噬細胞NO 生成的影響如圖6，在7個作用濃度下枸杞發酵液均可以促進小鼠腹腔巨噬細胞NO 生成。1 號枸杞發酵液在稀釋倍數為103濃度時，NO2-生成濃度最大，促進NO的生成最明顯，同時NO 生成量和作用濃度呈倒-U 型量效關系。2 號和3 號枸杞發酵液均能促進NO 的生成。

圖6 枸杞發酵液對體外小鼠腹腔巨噬細胞NO生成量的影響Fig.6 Impacts of Lycium chinense Mill fermentation liquid on in vitro NO production by mice peritoneal macrophages

3 結論與討論

當機體存在大量的非生理水平的ROS 時，除了擾亂細胞正常的信號通路外，還會和多種細胞結構成份包括脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、蛋白質、脂類在內的生物大分子發生反應，對機體產生一系列損害以致引發疾病。氧化應激與多種疾病中包括動脈粥樣硬化、糖尿病、肺纖維化、肝硬化、神經退行性疾病和關節炎有著密切的關系，是衰老的主要原因[8]。同時，抗氧化劑可以使免疫系統保持活力，維持人體的穩定狀態。

本研究表明：枸杞發酵液具有較好的清除細胞內ROS 水平的能力、促進脾淋巴細胞增殖和提高LPS 誘導的腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力，這3 種不同來源的枸杞發酵液在稀釋倍數為10、102和103濃度時作用明顯，1 號產品的稀釋倍數為102濃度為后續相關試驗研究具有借鑒意義。枸杞發酵液具有抗氧化和免疫調節能力這可能與其含有豐富的有機酸、維生素和礦物質有關。經前期研究發現，枸杞發酵液中含有23.07 g/L的有機酸，主要是乳酸、酒石酸和草酸等。枸杞中具有免疫調節的多糖類物質經發酵后分解為小分子糖類，更易于人體吸收利用，發揮功效作用。豐富的維生素、礦物質、黃酮類，有機酸和糖醇類物質協同發揮抗氧化和免疫調節作用，作用機理、量效關系和物質結構鑒定需要進一步的研究。