超聲波輔助酶法提取毛木耳多糖工藝條件優化

馬昱陽，賈鳳娟，徐志祥，弓志青，王月明，王文亮，*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.山東省農業科學院農產品研究所，山東 濟南 250100；3.山東省農產品精深加工技術重點實驗室，山東 濟南 250100；4.農業部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100）

毛木耳（Auricularia polytricha）別名白背木耳、黃背木耳、粗木耳、大木耳等，與黑木耳同屬木耳科[1]。在我國毛木耳是一種常提及到的醫食兩用的大型食用真菌，與黑木耳相比較，毛木耳子實體肥大且厚實，價格比黑木耳便宜很多。毛木耳富含膠體，口感爽滑且清脆，營養物質豐富，環境適應性較好、產量較高。另外毛木耳在藥用功能方面越來越得到廣大蕈菌科技工作者的關注和消費者的喜愛[2]。

毛木耳多糖屬于酸性多糖，具有提高機體免疫力[3]、抗癌抑癌[4]、抗氧化衰老[5]、降低血糖[6]、調節心臟功能等功效[7]，毛木耳多糖的提取是多糖廣泛應用的第一步，因此毛木耳多糖提取優化方法的研究對毛木耳多糖生物活性研究和產品開發具有重要意義。

目前，毛木耳多糖提取的傳統方法主要有熱水浸提法、酸堿浸提法、乙醇浸提法[8]。傳統的提取方法提取時間相對較長、成本高、提取率較低。超聲波輔助法提取多糖是近年來新興的提取方法，具有時間短、提取效率高、操作方便無污染等優點[9]，本試驗采用超聲波輔助酶法提取毛木耳多糖，通過進行液料比、超聲波時間、超聲波功率、復合酶（復合蛋白酶與纖維素酶質量比為1∶1）酶解溫度4個單因素試驗確定影響多糖提取率的主要因素，采用響應面Box-Behnken 試驗設計優化提取工藝條件，進行分析，建立回歸數學模型[10]，得到超聲波輔助酶法提取毛木耳多糖工藝的最優參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛木耳：山東省魚臺縣；纖維素酶（15 000 U/g）、復合酶（150 U/mg）：源葉生物公司；苯酚、無水葡萄糖（分析純）：天津市化學試劑三廠；濃硫酸（分析純）：開封東大化工試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

SB25-12DTD 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-6100 紫外-可見光分光光度計：上海元析儀器公司；CP2102 電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；LXJ-IIB 高速離心機：德國eppendorf 公司；HH-6 數顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；VORTEX-6 電動震蕩器：上海其林貝爾有限公司；FN-202 型小型粉碎機：北京興時種和科技發展發展有限公司；LGJ-25 冷凍干燥機：解放軍軍事醫學科學院。

1.3 方法

1.3.1 毛木耳的預處理

將毛木耳浸泡于水中12 h 后取出切成絲晾干，在60 ℃的恒溫條件下干燥24 h，冷卻后用粉碎機將烘干的毛木耳絲進行粉碎處理，過100 目篩將粉碎后的毛木耳放入密封袋于玻璃干燥皿中保存。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制作

稱適量標準葡萄糖粉末于干凈的稱量皿中，然后置于105 ℃烘箱中烘干，大約4 h 至恒重。然后精確稱取烘干粉末0.5 g 至100 mL 容量瓶定容，再取出1 mL溶液于50 mL 容量瓶中定容，得到0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液，準備潔凈試管，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 定容液，再分別加 1 mL 蒸餾水、1 mL 6%苯酚，混勻后再緩慢加入5 mL 濃硫酸，震蕩混勻，沸水浴中加熱15 min 后迅速冷卻，490 nm 處測吸光值，每個樣品平行測定3 次。然后，葡萄糖濃度與所測吸光值分別為橫縱坐標，作出葡萄糖標準曲線[11]，如圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.3.3 毛木耳多糖的提取

取毛木耳粉 1.0 g，配制成 40∶1（mL/g）液料比的溶液，在150 W 超聲波功率下超聲20 min 取出加入一定量的復合酶（纖維素酶∶復合蛋白酶質量比為1∶1），在一定酶解溫度條件下浸提2 h，浸提結束后滅酶后處理，將浸提結束的毛木耳液進行離心，離心條件為10 000 r/min 離心15 min，離心結束分離上清液與沉淀物，將上清液取1 mL 定容至100 mL 的容量瓶中，制備成樣液測定多糖含量。準確吸取多糖樣液1.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，同標準曲線之操作，測定吸光度值。將測定的吸光值帶入多糖計算公式，即可得多糖的含量[12]。

樣品多糖得率/%=多糖質量濃度×稀釋倍數×樣液體積×10-6/1 g 樣品

1.3.4 單因素試驗設計

選擇超聲波功率、液料比、超聲波時間、復合酶酶解溫度4個影響因素做單因素試驗，根據試驗結果結合實際情況篩選出主要影響因素進行響應面優化試驗。

1.3.5 響應面法優化試驗

在單因素試驗的基礎上確定主要影響因素，采用SAS（V8.02）中的Design of Experiment（DOE）模塊進行試驗設計和多項式回歸分析，最后建立二次響應回歸模型，通過擬合獲得回歸方程，得出最佳工藝條件[13]。

1.4 統計分析

每個試驗重復3 次，結果表示為Means±S.D.采用ORIGIN（Origin Pro 8.5.0 SR1）做圖。方差分析采用SAS（V8.02）軟件的一般線性模型（GLM），顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為 P＜0.01[14]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對毛木耳多糖得率的影響

在5個50 mL 離心管中各加入1 g 毛木耳粉，分別按液料比 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）加入蒸餾水在超聲功率150 W 下超聲30 min，然后加入一定量的復合酶與纖維素酶（復合酶∶纖維素酶=1∶1，質量比）在60 ℃條件下加熱2 h，滅酶，10 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液稀釋100 倍，用硫酸-苯酚法測定多糖含量。試驗結果如圖2所示。

圖2 液料比對多糖得率的影響Fig.2 The effect of liquid material ratio on the polysaccharides extraction rate

由圖2可知，在一定的液料比范圍內，多糖的提取率呈先上升后下降的趨勢，在 40∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）液料比時多糖得率最大。溶劑太少，原料不能充分溶解，溶劑量加大增大了毛木耳粉與溶劑間接觸面，利于多糖提取。過量的液料比會導致毛木耳粉吸收的超聲波能減少，多糖溶解不充分[15]。因此選用液料比為40∶1（mL/g）。

2.1.2 超聲波功率對毛木耳多糖得率的影響

在5個50mL 的離心管中各裝入1 g 毛木耳粉，按液料比 40∶1（mL/g）的比例加入蒸餾水，分別以 100、150、200、250、300 W 超聲波功率條件下超聲 30 min，然后 60 ℃水浴浸提 2 h，10 000 r/min 離心 15 min，取上清液稀釋100 倍，用硫酸-苯酚法測定多糖得率。試驗結果如圖3所示。

圖3 超聲波功率對多糖得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on the polysaccharide extraction rate

由圖3所示，超聲波功率從100 W 開始逐漸增加，最后到300 W，多糖得率呈現先增大后減小的趨勢，超聲波功率在150 W 時多糖提取率最高，超聲波功率過小或者過大都不利于多糖的提取，表明超聲波功率對得率影響較顯著，因此綜合考慮超聲波功率在150 W 為宜。

2.1.3 超聲波時間對毛木耳多糖得率的影響

在5個50 mL 的離心管中各裝入1 g 毛木耳粉，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，在超聲功率為150 W條件下進行處理，處理時間為 10、20、30、40、50 min，超聲波處理結束后進行浸提，時間2 h，溫度60 ℃，浸提結束后進行離心，離心條件為10 000 r/min、時間為15 min，離心結束取上清液1 mL 稀釋100 倍，用硫酸-苯酚法測定多糖得率。試驗結果如圖4所示。

圖4 超聲波時間對多糖得率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on the polysaccharide extraction rate

由圖4可知，提取時間在10 min～30 min 時，隨著超聲波時間的延長，多糖提取率逐漸增大，多糖得率由13.35%增大到13.95%。這是由于處理時間過短，超聲波對物料細胞膜的破壞作用有限，使得多糖得率較低，隨時間的延長超聲波對細胞膜的破壞作用增大，多糖溶出增多，使多糖得率相應增加[16]，但超過30 min 后多糖得率不再增加，因此初步確定超聲處理時間為30 min。

2.1.4 酶解溫度對毛木耳多糖得率的影響

在5個50 mL 的離心管中各裝入1 g 毛木耳粉，按液料比40∶1（mL/g）加入蒸餾水，在超聲功率為150 W 條件下進行超聲波處理，處理時間為30 min，然后分別在 55、60、65、70、75 ℃條件下進行浸提，浸提時間為2 h，浸提結束后離心，條件為10 000 r/min 離心時間15 min，取離心得到的上清液1 mL 稀釋100 倍，然后用硫酸-苯酚法測定多糖得率。試驗結果如圖5所示。

復合酶采用纖維素酶和復合蛋白酶，兩種酶的添加比例為1∶1。由圖5所示，在一定的范圍內隨著溫度的持續升高，毛木耳多糖的含量以55 ℃為起點呈現先增加后減少的趨勢，在酶解溫度65 ℃時多糖的得率最高，隨著提取溫度的持續升高，則多糖的含量慢慢降低。因此酶解溫度在65 ℃時效果最優。

圖5 復合酶解溫度對多糖得率的影響Fig.5 The effect of enzymolysis temperature on the polysaccharides extraction rate

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面分析試驗設計及結果

單因素試驗確定超聲波功率、超聲波時間、酶解溫度3個因素為毛木耳多糖提取的主要影響因素。為了得到最佳工藝條件，通過Box-Behnken 設計進行優化試驗，試驗因素與水平具體見表1。響應面優化試驗方案及試驗結果見表2。利用SAS 的響應面模塊將表2試驗數據擬合二次多項式回歸模型，結果如下：

Y=-175.797 50+0.140 45×A+0.433 14×B+5.375 25×C+0.000 135E×A×B-0.000 93E×A×C-0.005 3E×B×C-0.000 264E×A2-0.001 825E×B2-0.0395×C2

表1 Box-Behnken試驗設計方案Table 1 Box-behnken design scheme

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 RSA design scheme and experimental results

續表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 RSA design scheme and experimental results

對表2中試驗結果進行統計分析，得方差分析結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）

由表3可知，響應面模型的F=12.96、P=0.001 4＜0.01，該模型水平明顯，且模型顯著的程度較高（P＜0.01），失擬項不明顯（P=0.673 6＞0.05）。模型的系數R2=0.943 4，該值能夠將回歸方程較好地模擬真實曲面程度，證明該試驗的方法以及數據是可靠的[17-19]。因此，該模型方程可用于分析不同條件下提取毛木耳多糖得率的變化情況。根據表3中的方差分析結果，可見一次項超聲波功率、酶解溫度對多糖提取率影響顯著；超聲波時間影響不顯著，二次項超聲波功率的平方、酶解溫度的平方對響應值多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）；其余項均不明顯（P＞0.05）。

2.2.2 響應面交互作用分析

根據回歸模型，將任一因素固定在零水平，可以得到體現另外2個因素及其交互作用影響的響應曲面圖及對應的等高線圖，見圖6～圖8。

圖6 超聲波功率和超聲波時間對多糖提取效果影響的等高線及響應面Fig.6 Contours and response surfaces for ultrasound power and ultrasound time effects on polysaccharide extraction

圖7 超聲波功率和酶解溫度對多糖提取效果影響的等高線及響應面Fig.7 Contours and response surfaces for ultrasound power and enzymatic temperature effects on polysaccharide extraction

由圖6～圖8和表3可知，模型中的超聲波功率、酶解溫度一次項有顯著影響，超聲波功率、酶解溫度的二次項對毛木耳多糖得率有極顯著影響，而超聲波功率和超聲波時間之間、超聲波功率和酶解溫度之間、超聲波時間和酶解溫度之間的交互作用較小，對毛木耳多糖得率影響較小。

2.2.3 毛木耳多糖提取工藝條件的確定與驗證

根據響應面模型及數據通過Design Expert 軟件分析得到毛木耳中多糖提取的最佳條件為：超聲波功率161.35 W，超聲波時間31.67 min，酶解溫度64.01 ℃，在最優條件下，軟件分析得到毛木耳多糖提取最優得率的預測值為14.445 6%。結合實際以及操作實現性，將提取工藝參數稍作調整：超聲波功率160 W，超聲波時間31 min，酶解溫度64 ℃。為驗證響應面法預測值的可靠性，進行毛木耳多糖的提取試驗，在最佳優化提取條件下重復試驗3 次，得到毛木耳多糖的得率的平均值為14.41 %，與軟件分析得到的最佳預測值14.445 6%非常靠近，說明響應面實驗可以較好的分析出毛木耳多糖提取的最佳條件。

圖8 超聲波時間和酶解溫度對多糖提取效果影響的等高線及響應面Fig.8 Contours and response surfaces for the effect of ultrasound time and enzymatic temperature on extraction of polysaccharides

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面方法設計實驗及處理結果，建立毛木耳中多糖提取的二次多項式回歸模型。經過數據的分析與處理，證明該方法能夠準確地確定毛木耳多糖的最佳提取條件并做出提取率的預測值。綜合考慮實際條件，確定超聲波輔助酶提取毛木耳多糖的最佳提取條件為：液料比為40∶1（mL/g），超聲功率160 W，超聲時間31 min，在此條件下毛木耳多糖的提取率為14.41%，與響應面的預測數值基本接近，證明響應面優化法得到的毛木耳多糖的提取工藝準確合理，數據可用。可以為毛木耳中多糖提取生產提供一定的理論參考。