柱前衍生法測定功能性飲料與口服液中的牛磺酸

徐彬，李飛，趙海萍，程立媛，*

（1.海南省食品檢驗檢測中心，海南 海口 570314；2.河北工程大學，河北 邯鄲 056038）

牛磺酸（taurine），因存在于牛黃中，后經分離，故得名牛磺酸。牛磺酸以游離的狀態存在于人體，雖然不參與人體蛋白的合成，但卻與體內胱氨酸、半胱氨酸的代謝有關系。針對牛磺酸的生理功能和藥物作用，有學者做了相關的詳細研究。其中舒志成等[1]提出，牛磺酸可以提高機體的免疫力，同時給予人體能量，這個作用和咖啡因的外源性刺激有明顯的不同。楊祖英等[2]提出牛磺酸直接參與細胞膜的穩定，有一定的抗氧化和外源性化合物解毒作用，且具有多種生物活性，在預防醫學領域有一定的應用前景。但牛磺酸合成酶在人體活性較低，所以人體牛磺酸主要來源于外界的攝取。高亞等[3]對牛磺酸的降血糖作用進行了系統的梳理，為其在功能食品領域提供了參考依據。

牛磺酸在海產品中含量較高，其中徐莉等[4]研究了海口地區牡蠣中牛磺酸的含量，有的達到了9.52 mg/g。高加龍等[5]對南海不同產地的近江牡蠣也進行了牛磺酸衍生研究，徐成等[6]采用超高壓法提取牡蠣中的牛磺酸，最高提取量達到了22.96 mg/g，更加印證了牡蠣中高含量牛磺酸的存在。王芬等[7]對紫菜中的牛磺酸進行了鄰苯二甲醛衍生處理，也得到了較好的結果。人乳和牛乳在不同時期含有的牛磺酸含量也不同[8]，其中前者約是后者的8.2 倍，尤其在初乳期（產后0～14 d），最大含量可達17.8 mg/100 g，因此應大力提倡母乳喂養。不同國家對牛磺酸的年均消費量差別比較大，中國的年消費量僅為2 g/年，大大低于平均消費水平，提高牛磺酸的攝入量，勢在必行。

牛磺酸作為添加劑，允許其添加在奶粉，含乳飲料，功能性飲料，保健食品中，并被強制性添加入嬰幼兒配方奶粉，目前含有牛磺酸的功能性飲料和口服液品種較多，針對其中的牛磺酸檢測方法也是各有優劣，而其中主要檢測的方法包括熒光光譜法[9]，自動氨基酸分析法[10]，薄層色譜法[11]，離子交換紫外分光光度法[12]和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13-14]。其中薄層色譜法是一種半定量方法，但此種方法的薄層板厚度，薄層板制備技術，點樣技術和展開條件難以保持不變，這影響了定量分析的準確性，因此應用較少。熒光法對樣品的衍生化要求較高，往往需要添加還原劑，試驗條件較難控制。自動氨基酸分析方法是一種在線添加衍生化試劑的分析方法，其分析類型和數量有限。而高效液相色譜法靈敏度高，效率高，分離性能優異，幾乎不會對物質造成損害，可靠性好，分析時間短，流動相條件溫和，因此應用較廣。

針對市面上標識有牛磺酸的功能性飲料和口服液，有較多的學者進行了高效液相色譜衍生分析，得到了較好的結果，其中選用的衍生試劑有9-氯甲酸芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC）[15]，鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）[16-18]，異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）[19-20]，2，4 二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）[21-23]，2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNClB）[24]，丹磺酰氯[25]，具體試驗條件以及相應結果列于表1。

表1 功能性飲料和口服液中牛磺酸的衍生反應一覽Table 1 Overview of derivatization reactions of taurine in energy drinks and oral liquids

續表1 功能性飲料和口服液中牛磺酸的衍生反應一覽Continue table 1 Overview of derivatization reactions of taurine in energy drinks and oral liquids

丹磺酰氯也可以用于衍生處理其他基質中的牛磺酸，David 等進行了牛奶和嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸衍生的研究。作者匯總了20個實驗室對8個盲樣的分析結果，認為當固體樣品牛磺酸含量在5 mg/100 g～100 mg/100 g 范圍，使用此種衍生方法比較合適。但對于內源性牛磺酸含量低于3.5 mg/100 g 的樣品，精密度則較差[26]。Biondi 等采用丹磺酰氯對血漿中的牛磺酸進行了衍生處理，采用高效液相色譜-熒光檢測器檢測衍生產物，試驗中對哺乳動物狗，貓，以及貓耳草中含有的牛磺酸進行了檢測，通過加入內標物的方法進行定量，也得到了比較好的結果[27]。丹磺酰氯作為衍生劑有很多的優勢，比如：操作比較簡單、衍生產物穩定、熒光或紫外吸收強、靈敏度高等。本文在GB5009.169-2016《食品安全國家標準食品中牛磺酸的測定》基礎上[28]，針對衍生試驗中涉及衍生溫度，衍生時間，衍生劑用量以及衍生溶液pH 值，使用單因素試驗和正交試驗相結合的方式進行了條件的優化，并對功能性飲料和口服液中的牛磺酸進行了測試分析。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛磺酸：分析純，99.0%，北京百靈威試劑有限公司；丹磺酰氯（色譜純，98%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（HPLC）：韓國德山藥品工業；乙酸鈉：優級純，天津市光復科技發展有限公司；冰乙酸：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；鹽酸：分析純，煙臺市雙雙化工有限公司；無水碳酸鈉：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；有機濾膜（0.45 μm）：上海市新亞凈化器件廠。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100 液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）：美國安捷倫科技公司；ABS240 電子分析天平：上海梅特勒公司；系列移液器（10 μL～100 μL；20 μL～200 μL；100 μL～1 000 μL；1 000 μL～5 000 μL）：大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18 柱（150 mm×5.0 mm，4.6 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：乙酸鈉（pH=4.2）-乙腈（體積比 70∶30）等度洗脫；流速：0.8 mL/min；紫外檢測器波長：254 nm；進樣量：5 μL。

1.3.2 溶液配制

牛磺酸標準儲備液：準確稱取1.010 g 牛磺酸標準品，加水定容至100 mL，得到濃度為10 mg/mL 的牛磺酸標準儲備液，使用時用水稀釋至所需濃度。

丹磺酰氯衍生劑：準確稱量0.153 g 丹磺酰氯，乙腈定容至100 mL，得到1.5 mg/L 的丹磺酰氯乙腈溶液，此衍生試劑在4 ℃避光可保存1個月。

鹽酸衍生終止溶液：準確量取0.9 mL 濃鹽酸，加水定容至10 mL，此溶液室溫可保存3個月。

碳酸鈉緩沖液：準確稱量0.424 g 無水碳酸鈉，先用40 mL 水溶解，使用鹽酸溶液調節pH 值為9.5，最后加水定容至50 mL，此溶液室溫可保存1個月。

乙酸鈉緩沖溶液：準確稱量0.82 g 乙酸鈉，先溶于800 mL 超純水中，用冰乙酸調節溶液pH 值為4.2，最后加水定容至1 000 mL，現配現用。

1.3.3 衍生方法

單因素試驗主要考察衍生溫度、衍生時間、衍生劑用量和衍生溶液pH 值4個因素，篩選單因素試驗條件時，需要同時固定其它3個條件，改變待測試的試驗條件，每個單因素試驗至少做3 組。

正交試驗是在單因素試驗的基礎上，綜合考察衍生溫度、衍生時間、衍生劑用量和衍生溶液pH 對牛磺酸衍生物峰面積的影響。選取四因素三水平的正交試驗設計表，試驗以牛磺酸衍生物的峰面積作為考察指標，確定反應最優條件組合，具體因素水平表列于表2。

衍生試驗基本步驟如下：使用10 mL 具塞管進行衍生試驗，分別加入1 mL 碳酸鈉緩沖溶液，1 mL 樣品，一定體積的丹磺酰氯，然后立即放入溫度已經穩定的水浴鍋中，一定時間后取出，加入100 μL 鹽酸溶液終止試驗。溶液過0.45 μm 有機濾膜，待上機測試，牛磺酸的含量采用外標法定量。

表2 四因素三水平表格Table 2 Orthogonal table of four factors and three levels

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

試驗均選取15 μg/mL 的牛磺酸工作液作為衍生對象，以牛磺酸衍生物峰面積作為考察指標。

2.1.1 溶液pH 值

固定衍生反應溫度35 ℃，衍生時間35 min，衍生試劑用量300 μL，調節衍生溶液的pH 值為8、9.5、11（通過加入鹽酸溶液調節），不同pH 值條件下測得牛磺酸衍生物峰面積分別為：236.0，469.4，312.6，因此確定衍生溶液的pH 值為9.5。

2.1.2 衍生時間

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生溫度35 ℃，衍生劑用量 300 μL，調整衍生時間為 10、20、35 、50 min，不同衍生時間下得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為364.9，453.1，469.4，421.0，從結果可以得到牛磺酸溶液在35 min 即可衍生完全，確定衍生時間為35 min。

2.1.3 衍生溫度

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生時間35 min，衍生劑用量 300 μL，改變衍生反應溫度為 25、35、45、55 ℃，得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為：373.0、469.4、403.8、342.1，可以看出，隨著溫度的升高，牛磺酸衍生物峰面積先增加后降低，在35 ℃出現了最大值，因此選取衍生溫度為35 ℃。

2.1.4 衍生劑用量

固定衍生溶液pH 值為9.5，衍生時間為35 min，衍生反應溫度為35 ℃，選取衍生劑用量為100、200、300、400 μL，得到的牛磺酸衍生物峰面積分別為：122.8、243.8、469.4、439.5，隨著衍生劑用量的增加，峰面積也呈現先上升后降低的趨勢，綜合考量選取衍生劑用量為 300 μL。

2.2 正交試驗結果及直觀分析

在單因素試驗的基礎上，采用四因素三水平的正交試驗，進一步驗證衍生反應組合條件，對應的因素名稱和水平選擇以及相應的正交試驗結果列于表3。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

圖1是針對正交試驗結果進行的直觀分析圖。

圖1 丹磺酰氯衍生牛磺酸正交試驗直觀分析圖Fig.1 Visual analysis of orthogonal experiment of taurine derived from dansyl chloride

通過圖形，可明顯看出，在溫度為35 ℃，衍生時間為35 min，衍生劑用量為300 μL，衍生溶液pH 值為9.5 時，牛磺酸衍生物峰面積達到最大值。對正交試驗結果進行極差分析，可以發現衍生劑用量對試驗結果影響較大，但是當衍生劑增大到一定程度時，對結果的影響反而變小。而對于衍生時間和衍生溶液的pH值而言，則存在最佳的條件。因此確定后續試驗的衍生試驗條件組合為衍生溫度35 ℃，衍生時間35 min，衍生劑用量300 μL，衍生溶液pH 9.5。

2.3 標準譜圖

空白衍生試劑以及牛磺酸標準品色譜圖見圖2。

從圖2（a）中可以明顯看出空白衍生試劑僅有丹磺酰氯色譜峰，而牛磺酸標準品的色譜圖（圖2（b））則包含丹磺酰氯峰以及牛磺酸衍生峰，且兩峰分離度較好（R＞3）。

圖2 衍生色譜圖Fig.2 Derivatization chromatogram

2.4 牛磺酸標準曲線

對牛磺酸標準工作溶液進行衍生，衍生物峰面積對濃度作圖，得到回歸方程為y=11.933x-4.838 7，相關系數為 0.999，表明牛磺酸濃度在 5 μg/mL～50 μg/mL時，峰面積對其呈現良好的線性關系，標準曲線列于圖3。

圖3 牛磺酸標準工作曲線Fig.3 Standard working curve of taurine

2.5 方法重復性

為了考察所建立方法的重復性，在最優的試驗條件下，對同一濃度的牛磺酸標準溶液進行6 組平行衍生實驗，得到的牛磺酸衍生物峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.4%，保留時間的RSD 值為0.3%，說明該方法的重復性較好。

2.6 樣品測定

依據牛磺酸線性濃度范圍，酌情稀釋所要測定的功能性飲料和口服液樣品，并在最優的試驗條件下，進行樣品衍生試驗，衍生試驗結果如表4。

表4 功能性飲料和口服液樣品中牛磺酸含量一覽表Table 4 List of taurine contents in functional beverages and oral liquid samples

續表4 功能性飲料和口服液樣品中牛磺酸含量一覽表Continue table 4 List of taurine contents in functional beverages and oral liquid samples

從表中可以看出，樣品測量值與實際標示值的誤差在-10.0%～+10.0%之間，對其中功能性飲料中的樣品7 和樣品9（加標水平均為0.5 mg/mL）進行加標回收測試，回收率分別為108.0%和94.6%之間。對口服液的3個樣品（樣品13、樣品14、樣品15）進行加標回收測試，加標水平分別為0.39、5.0、0.4 mg/mL，加標回收率分別為90.7%、103.3%和107.6%。針對口服液的3個樣品，每個樣品均做了平行測試，測試得出的平均偏差分別為2.7%、2.8%、2.5%。

其中樣品7 以及樣品9 的譜圖以及加標譜圖列于圖4。實際樣品在牛磺酸位置處無明顯干擾峰，且和標準的牛磺酸保留時間基本一致，可判定為同一種。

圖4 樣品以及加標樣品特征譜圖Fig.4 Characteristic chromatograms of samples and spiked samples

3 結論

通過單因素和正交試驗相結合的方式確定了丹磺酰氯衍生牛磺酸的試驗條件，在衍生溫度為35 ℃，衍生時間35 min，衍生劑用量300 μL，衍生環境pH 值為9.5 時，衍生效果較好。牛磺酸的濃度為5 μg/mL～50 μg/mL 時，線性相關性較好，6 組重復性試驗的RSD值為1.4%，對功能性飲料和口服液中牛磺酸含量進行了測試分析，測量值與標識值誤差在-10.0%～+10.0%，樣品平行測試偏差較小，綜上此種方法反應條件溫和，實際操作性較強。