LC-MS/MS測定雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲腈及代謝物殘留量

王永芳，王利強，溫華蔚

（天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300461）

氟蟲腈是一種苯基吡唑類廣譜殺蟲劑[1]，氟蟲腈的代謝產物主要有氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜、氟甲腈3種，對蚜蟲、葉蟬、飛虱、鱗翅目幼蟲、蠅類和鞘翅目等重要害蟲有很高的殺蟲活性，對作物無藥害，但由于氟蟲腈代謝產物的毒性比母體大很多[2]，有些國家也禁止使用氟蟲腈進行防蟲[3-4]。氟蟲腈可能會損害肝臟、甲狀腺和腎臟，但不會引起基因突變、致癌或對生殖能力、胎兒造成影響。氟蟲腈主要用于對跳蚤、虱子、蟑螂、螨、螞蟻等蟲害的防治。畜禽養殖生產中禁止使用該類殺蟲劑。全球也對雞蛋中氟蟲腈殘留量更加地關注。

基于氟蟲腈的危害性和風險性，禁止在用于食品加工的動物養殖過程中使用氟蟲腈。國際食品法典（Codex Alimentarius Commission，CAC）和日本食品安全標準中規定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為0.02 mg/kg；美國相關標準規定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為0.03 mg/kg；歐盟規定：雞蛋和雞肉中氟蟲腈最大殘留限量為0.005 mg/kg。國內GB 2763-2016《食品安全國家標準農藥最大殘留限量》中明確了氟蟲腈在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖類和食用菌中的限量[5]（玉米及鮮食玉米0.1 mg/kg，其他為0.02 mg/kg），對于其在蛋類和肉類中的最大殘留限量沒有做出規定。目前，國內關于食品中氟蟲腈檢測的相關標準中[6-8]，未涉及到雞蛋的檢測。目前關于雞蛋等動物性產品中氟蟲腈檢測方法的文獻越來越多，涉及到的方法有氣相色譜法[9]、氣相色譜-質譜法[10-13]、液相色譜質譜法[14-17]，上述方法只是檢測雞蛋中或者雞蛋及蛋制品中氟蟲腈及代謝物的測定，本研究建立一個既適用于雞蛋、蛋制品，又適用于雞肉的液相色譜－串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測方法。通過建立該方法，可以對進口雞蛋、蛋制品和雞肉進行有效把關，同時對保障國內雞蛋、蛋制品和雞肉的質量安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器

雞蛋、雞肉、蛋糕：市售。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜：純度＞98.0%，德國 Dr.Ehrensorfer 公司；乙腈：色譜純，迪馬科技有限公司；正己烷：色譜純，默克股份兩合公司；丙酮：色譜純，默克股份兩合公司；乙酸銨：分析純，天津風船試劑科技有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲酸：迪馬科技公司；Cleanert PEP Plus（60 mg/3 mL）：博納艾杰爾科技有限公司；Florisil 固相萃取柱、C18 固相萃取柱：美國Supelco 公司。含10 mmol 乙酸銨的0.1%甲酸-水溶液：稱取0.78 g 乙酸銨，溶解于1 L 高純水中，再加入1 mL 甲酸，搖勻，常溫保存，現用現配。

6460 液相色譜串聯質譜儀：安捷倫科技有限公司；B-100 旋轉蒸發儀：瑞士 Buchi 公司；Milli-Q Advantage A10 純水儀：美國 Millipore 公司；PL602-L 電子天平：梅特勒-托利多公司；Promax-2020 型水瓶往復振蕩器：德國Heidolph 公司；Model 231 渦旋式振蕩器：美國 Scientific Industries 公司；Ultra-turrax T25 均質器：Janke & Kunkel IKA-labortechnik；攪蛋器、粉碎機：美的集團有限公司；實驗室用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取10.0 mg（精確至0.1 mg）標準物質分別于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成1 000 μg/mL 的標準溶液，于-20 ℃冰箱進行保存。工作液的配制：根據試驗的需要，用相應的空白基質溶液配制成一系列濃度的工作液。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：0.1 %甲酸乙腈（A）和添加10 mmol 乙酸銨和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Elution gradient of mobile phase

1.2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓：4 000 V；霧化氣壓力：2.7×105Pa 離子源溫度：350 ℃；定性離子對、定量離子對、毛細管出口電壓、碰撞能量，見表2。

表2 氟蟲腈及其代謝物色譜質譜參數Table 2 Mass spectrometer parameters of fipronil and its metabolites

1.2.4 樣品前處理

1.2.4.1 樣品提取

雞蛋去殼后，用攪蛋器充分攪勻，備用；將雞肉、蛋糕用粉碎器粉碎均勻，備用。取2 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 離心管中，雞蛋樣品中加水1 mL，雞肉和蛋糕中加水5 mL，渦旋振蕩2 min，加入含1%甲酸乙腈10 mL，渦旋混勻后，進行超聲輔助提取10 min，加入 1 g NaCl，渦旋 1 min，8 000 r/min 離心 5 min，上清液待凈化。

1.2.4.2 樣品凈化

取上述待凈化提取液2 mL，加入到PEP Plus 萃取柱中，前0.5 mL 流出液棄去，收集剩余的上樣流出液。取出0.5 mL 收集液，再向其中加入0.5 mL 水，混勻后，過 0.22 μm 過濾膜，上機測定。

2 結果與討論

2.1 液相和質譜條件的優化

氟蟲腈及其代謝物為中等偏弱極性化合物，通過參考文獻資料[18-21]，目標物在C18 色譜柱上應具有較強保留，本試驗最終選擇Eclipse C18 色譜柱，考慮到基質中雜質的影響，為使目標化合物獲得較好的分離和峰形，降低基質效應的干擾，本方法選取梯度洗脫模式，比對乙腈-水、甲醇-水、乙腈（含0.1 % 甲酸）-10 mmol/L 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），通過對流動相進行考察，采用0.1%甲酸的乙腈作為有機相，含有10 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為水相，目標化合物可以很好的基線分離，獲得很好的峰形，確定為最終的液相條件。

本方法采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），氟蟲腈及代謝物結構中含有較多鹵代基，在源內易形成負離子，在負離子模式下有更好的響應，因此采用ESI-作為電離條件；配制50 ng/mL 的氟蟲腈及其代謝物標準品，進樣確定質譜參數。先對目標物進行一級質譜分析，確定其分子離子峰[M-H]-作為母離子，以母離子響應為指標，分別對毛細管出口電壓進行優化，確定最優參數進行二級質譜分析，選取響應最強的兩個子離子，分別和母離子組合確定為定量離子對和定性離子對，并進一步優化碰撞電壓使各個離子對信號響應最強，確定為各自的定量參數（見表2）。在該優化條件下，雞蛋樣品和雞蛋樣品中添加1 μg/kg 濃度的多反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖，見圖1和圖2。

2.2 提取條件的選擇和優化

氟蟲腈為中等偏弱極性殺蟲劑，在提取過程中易溶于有機試劑，本試驗基質中雞蛋、雞肉的主要成分為水，約占70%，其次雞蛋中蛋白含量約占15%，脂肪約為12%，雞肉中蛋白含量約占20%，脂肪含量約占2.5%，蛋糕中的主要原料含有雞蛋、白糖、小麥粉等，根據基質的特點：含有水分、蛋白和脂肪，選擇合適的提取溶劑。加入提取溶劑之前加入適量的水，與基質充分混勻，將基質分散，利于有機溶劑進行提取。乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷是常用的提取溶劑，丙酮和乙酸乙酯在提取目標物的同時，也會萃取出含量較高的脂肪，不利于下一步凈化處理，乙腈在提取過程中，能很好的沉淀蛋白，減少脂肪和其他雜質的溶出，加入適當濃度的酸，能減少基質對氟蟲腈及其代謝物的干擾，加入適量NaCl 鹽析后更好地進行凈化。本試驗采用含1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

圖1 雞蛋樣品多反應監測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of egg sample

圖2 4種化合物的MRM色譜圖（1 μg/kg）Fig.2 MRM chromatograms of 4 compounds（1 μg/kg）

2.3 凈化條件的選擇和優化

目標物氟蟲腈及代謝物在提取過程中，將基質中少量的油脂、蛋白等成分提取出來，通過凈化，可以去除這些雜質的干擾，使得目標物分離的更好，同時減少雜質對儀器的污染。選擇Florisil 固相萃取柱、Cleanert PEP Plus 固相萃取柱，C18 固相萃取柱，通過回收率試驗進行比較，結果見圖3。

圖3 不同凈化柱對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.3 Comparison of recoveries using different clean-up column

Cleanert PEP Plus 柱在凈化過程中無需進行活化和洗脫，相比Florisil 固相萃取柱、C18 固相萃取柱，凈化過程可以節約更多時間，最終選擇Cleanert PEP Plus凈化柱進行試驗。

3 方法驗證

3.1 基質效應的考察

在使用液相色譜-串聯質譜儀測定樣品時，會存在基質效應（matrix effect，ME）問題。一般采用同一樣品的空白基質配制系列濃度的曲線進行校正定量，以抵消基質效應對方法的精密度和準確度產生的干擾[22]。本方法選擇空白雞蛋、雞肉和蛋糕經樣品前處理完，制備出空白基質，用該空白基質溶液和純試劑甲醇分別配制一定梯度濃度的標準曲線，用下列公式進行判斷基質效應的影響。ME/%=k2/k1×100，當ME＞100%時，表明基質增強效應；當ME＜100%時，表明基質抑制效應，式中：k1 為純試劑配制曲線的斜率，k2 為基質溶液配制曲線的斜率。氟蟲腈及其3 種代謝物在雞蛋、雞肉和蛋糕基質中的基質效應見表3。

表3 氟蟲腈及其3種代謝物在雞蛋、雞肉和蛋糕基質中的基質效應Table 3 The matrix effect of fipronil and its metabolites in chicken egg，muscle and cake

通過表3可以看出，氟蟲腈、氟甲腈和氟蟲腈亞砜在3 種基質中有基質抑制效應，氟蟲腈砜在雞蛋、雞肉中有基質效應不明顯。

3.2 方法的線性及靈敏度

選取雞蛋、雞肉和蛋糕空白樣品，分別添加1、2、5、10、20、50 μg/kg 梯度水平制作基質曲線，3 種基質的線性方程、相關系數R2等參數見表4。

氟蟲腈及代謝物曲線的線性關系良好，R2均大于0.99，各化合物的定量離子的信噪比均大于10，將氟蟲腈及代謝物的定量限均定為1 μg/kg，以3 倍信噪比確定為定性限，氟蟲腈及代謝物的定性限為0.4 μg/kg。

表4 氟蟲腈及代謝物的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限數據Table 4 Linear equations and correlation coefficients，liner range，LOD，LOQ data of fipronil and metabolites

3.3 方法的準確度和精密度

參考GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F 中檢測方法確認的要求中相關內容[23]，選取雞蛋、雞肉和蛋糕空白樣品，分別添加1（定量限）、2、5 μg/kg（限量值）3個水平，進行方法準確度和精密度試驗。每個濃度水平進行6 平行試驗。檢測結果見表5，其結果符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的相關要求。

表5 方法的平均回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and precision of the method（n=6）

3.4 實際樣品分析

從市場上抽取50 批次雞蛋和雞肉，20 批次蛋糕樣品進行檢測，均未檢測出陽性樣品。

4 結論

本研究建立了LC-MS/MS 法測定雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲腈及其3 種代謝物的測定方法。研究中優化了提取條件，凈化條件和色譜質譜條件，按優化參數進行方法學驗證，該方法的回收率、精密度、線性、測定低限等均滿足相關標準的技術要求，適用于雞蛋、雞肉和蛋糕中氟蟲腈及代謝物的快速檢測。