miR-596在老年胃癌組織中的表達及臨床意義

王福安

(平頂山學院醫學院，河南 平頂山 467000)

由于胃癌惡性程度高、死亡率高及易發生轉移等特征，對患者產生的影響十分嚴重，并且由于早期癥狀不明顯，大部分患者在發現后病情已處于嚴重階段，胃癌的早期診斷與臨床治療急需發展與創新〔1，2〕。相關研究實現，胃癌的發病率會隨著患者年齡的增長而升高，老年人群的患病率極高，且老年胃癌具有組織分化程度高、腫瘤惡性程度低及生物學侵襲性弱等特征〔3〕。對老年胃癌患者的生物學行為差異等進行分析，有助于老年胃癌的診斷及個性化治療。本研究擬分析miR-596高表達水平與低表達水平患者的臨床特征，利用CCK-8實驗與Transwell穿孔實驗分析AGS細胞的增殖與侵襲能力，分析miR-596在老年胃癌組織中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取90例老年胃癌患者作為研究對象，分別采集患者的胃癌組織和對應的癌旁組織樣本進行研究，男40例，女50例，年齡65～85〔平均(72.31±4.85)〕歲。納入標準：①簽署院內倫理委員會批準的研究實驗知情同意書；②經胃鏡病理檢查確診為胃部惡性腫瘤；③CT檢查等明確TNM分期為Ⅰ～Ⅳ期；④年齡在65周歲以上。排除標準：①術前進行放療、化療或是中西醫結合抗腫瘤治療患者；②病情嚴重無法簽署知情同意書患者；③合并其他嚴重器官疾病患者。

1.2儀器與試劑 普通冰箱、超低溫冰箱、PCR儀、顯微鏡、離心機、超凈工作臺、消毒器、微波爐以及電子分析天平等。美國Gibco公司的RPMI1640培養基與胎牛血清(FBS)、總RNA提取試劑盒Trizol、脂質體轉染試劑Lipofectamine2000、反轉錄試劑盒、SYBR RT-PCR檢測試劑盒、miRNA檢測試劑盒、miR-596mimics與陰性對照、CCK-8檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell平板。

1.3實驗方法 在胃癌組織樣本離體30 min之內，提取部分胃癌組織，并去除組織標本中的脂肪組織，使用含有10%FBS的RPMI1640培養基將胃粘膜上皮細胞和胃癌細胞放到培養箱中進行培養，培養條件為37℃和5%CO2，在細胞生長到90%匯合度后實施傳代。

使用胰蛋白酶對研磨后的組織進行離心處理，去除上清，隨后加入總RNA提取試劑Trizol及氯仿，將組織樣本進行4℃高速離心處理，提取處理后的上層澄清液體，再加入等量的異丙醇，再進行離心處理，去除上清，隨后使用75%的乙醇溶液進行洗滌，洗滌晾干后再加入水溶液，并測量濃度。隨后依照使用說明書，將制取的RNA反轉錄為cDNA，再利用SYBR RT-PCR檢測試劑盒，將U6作為內參，檢測不同樣本中的miR-596含量。實驗重復3次，且每組設置3個復孔。對比胃癌組織及癌旁組織的miR-596表達水平。

提取對數期生長的胃癌細胞，并將細胞鋪入孔板中培養24 h，隨后實施miRNA轉染，轉染過程中把轉染試劑與miR-596mimics與陰性對照進行混合，待靜止后將其加入到對應的孔中，轉染6 h后換液，并于48 h后進行后續的相關檢測。

在miRNA轉染完成48 h后，利用CCK-8檢測試劑盒進行細胞增殖檢測，嚴格依照試劑盒的說明書實施檢測，通過酶標儀于490 mm波長處，進行吸光度值測量，再減去空白孔值，得出檢測標本的細胞增殖檢測結果。

Transwell穿孔實驗：在miRNA轉染完成48 h后，對細胞進行消化后使用不含FBS的培養基對樣本進行重懸，并將相同數量的細胞放置于Transwell上層小室當中，下層放入含10%FBS的培養基，將其放置于培養箱中24 h，隨后觀察統計小室外層細胞核染色數量。

1.4統計學處理 使用SPSS18.0統計軟件進行χ2及t檢驗。

2 結 果

2.1胃癌組織和癌旁正常組織中的miR-596表達水平對比 胃癌組織中miR-596平均表達水平為(1.31±0.14)，癌旁正常組織中miR-596平均表達水平為(2.21±0.44)，miR-596在胃癌組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織中的表達(P<0.05)。

2.2miR-596高表達水平與低表達水平患者的臨床特征對比 90例患者中miR-596高表達水平患者42例，低表達水平患者48例，兩組患者的性別、腫瘤細胞分化程度差異無統計學意義(P>0.05)，淋巴結轉移患者中的高表達發生率顯著低于未轉移患者，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者中的高表達發生率顯著高于Ⅲ～Ⅳ期患者，腫瘤直徑<3 cm患者中高表達發生率顯著高于≥3 cm患者，老年胃癌患者的miR-596表達水平和患者的淋巴結轉移情況、TNM分期及腫瘤直徑具有顯著的相關性(P<0.05)。見表1。

表1 miR-596高表達水平與低表達水平患者的臨床特征對比分析〔n(%)〕

2.3過表達miR-596抑制癌細胞增殖與侵襲能力分析 轉染miR-596胃癌細胞的增殖作用顯著低于正常胃癌細胞(0.57±0.04 vs 1.01±0.08,P<0.05)，miR-596具有顯著的抑制胃癌細胞增殖的作用；Transwell穿孔實驗發現，轉染miR-596胃癌細胞長小孔的細胞數量顯著低于正常胃癌細胞(0.59±0.10 vs 1.02±0.17,P<0.05)，miR-596對于胃癌細胞的侵襲具有顯著的抑制作用。

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤中發病率位居首位，臨床研究數據表明，胃癌好發于50歲以上的人群中。胃癌的發病會受到內外部因素的影響，遺傳與基因、地域環境以及飲食結構、細菌感染和癌前病變等，是影響胃癌發病的主要因素〔4，5〕。相關研究數據顯示，與胃癌患者具有血緣關系的人群中，胃癌的發病率高出4倍，胃癌的發生與發展和患者自身的抑癌基因、轉移基因及凋亡相關基因具有密切的關系〔6〕。胃癌患者中大部分屬于腺癌，且患者在患病早期大多數不會出現明顯癥狀，少數患者可能出現惡心、嘔吐及上消化道癥狀，臨床表現和胃炎、胃潰瘍等慢性疾病相似，常常被忽視，當檢查確診胃癌時患者已處于病情較為嚴重的階段，對胃癌的早期診斷進行優化是十分必要的，對于及時發現和診治胃癌具有重要的意義〔7，8〕。老年胃癌相較于中青年患者來說，其預后狀況相對較好，患者的腫瘤分化程度較高、侵襲性相對較弱。在臨床治療中，胃癌治療主要采取的方式有手術治療、化療、細胞靶向治療及免疫治療等，當下大部分的胃癌治療方案中是將手術治療作為主要方式，并使用化療作為術后輔助治療，患者的復發率較高，術后患者的生存率無法得到有效保障〔9〕。

miRNA是一類內源基因編碼長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠在動植物中參與轉錄，對基因表達進行調控，目前為止，動植物和病毒中發現的miRNA分子已達到28 000個以上〔10〕。相關研究顯示，miRNA在30%以上的基因及60%以上的蛋白中能夠產生調控作用，在細胞發育、增殖及凋亡活動中能夠發揮重要作用。miRNA在癌癥發生與發展中的顯著作用逐漸被發現和證實，相關研究顯示，miR-29能夠對細胞周期蛋白CDC42表達產生抑制作用，從而對細胞凋亡產生促進作用；而miR-190能夠對血管內皮生長因子(VEGF)信號通路進行抑制，對于腫瘤新生血管的生成具有顯著的抑制作用；miR-125b能夠降低P53蛋白含量，促進癌細胞增殖作用〔11～13〕。隨著分子生物學的研究和在癌癥診治中的廣泛應用，miRNA在癌癥診治中發揮愈加重要的作用，基于miRNA在腫瘤組織與正常組織中的表達差異，miRNA能夠成為腫瘤疾病診斷的重要標志物，同時，基于miRNA在血液中的較強穩定性，能夠通過對患者外周血中miRNA表達進行檢測，對疾病進行診斷和臨床指導〔14〕。部分miRNA表達與胃癌的負相關關系被逐漸發現和證實，例如miRNA-935、miRNA-182等，均屬于具有抑癌性的miRNA，通過提升胃癌組織中的以上miRNA的表達水平，能夠起到胃癌控制與治療的作用〔15〕。

目前人類細胞中發現的miRNA分子已經達到1 100條，并且其在癌癥疾病中能夠發揮重要的影響。相關研究中顯示，miR-596能夠對口腔癌細胞當中的LGALS3-BP表達產生抑制作用，從而對MAPK信號通路產生影響，并降低癌細胞的增殖能力，對口腔癌病情發展產生積極影響〔16〕。另外，miR-596能夠對結腸癌患者的P53拮抗蛋白表達產生抑制作用，從而提升P53蛋白水平，起到促進結腸癌細胞凋亡的作用。RT-PCR檢測方法是目前常用的癌細胞檢測方法，檢測的準確性較高。本文中老年胃癌患者胃癌組織中miR-596相較于正常組織處于較低水平，表明miR-596低表達和老年胃癌患者的病情發生、發展具有密切關系，表明miR-596可以作為胃癌診斷的分子標志物，為胃癌的早期檢查診斷提供更加科學、嚴謹的依據。同時，老年胃癌患者胃癌組織中miR-596的低表達，在一定程度上證實了miR-596可能存在一定的抗癌性，為老年胃癌的治療提供了更加廣泛的研究方向。

本研究結果進一步表明了miR-596在老年胃癌患者中的抑癌作用，為疾病診斷、監測及靶向治療提供了更加科學的依據。

腫瘤細胞的增殖與侵襲是影響腫瘤發展的重要因素，對miR-596在老年胃癌患者胃癌細胞增殖與侵襲中的作用進行分析，能夠為疾病的診治提供更加科學的依據。本研究發現轉染miR-596后胃癌細胞的增殖能力顯著下降，說明miR-596具有顯著的抑制胃癌細胞增殖的作用，這一作用的實現可能與其對MAPK信號通路產生的作用機制是一致的。Transwell穿孔實驗結果表明miR-596對于胃癌細胞的侵襲具有顯著的抑制作用。在臨床治療中，通過增加胃癌組織中的miR-596表達，能夠起到疾病控制與治療的作用。通過深入的靶基因預測技術以及相關研究，能夠為老年胃癌的診治提供更加有效的方法。