α3神經型尼古丁受體基因下調對SH-SY5Y DYN1和AP180表達的影響

呂園園 王曉玲 鄧于新 李毅 官志忠 齊曉嵐

(貴州醫科大學 1地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2醫學分子生物學重點實驗室；3鄭州人民醫院檢驗科)

阿爾茨海默病(AD)已成為繼心腦血管疾病后威脅老年人健康的又一重要病種，且其死亡率的增長率排在第1位〔1,2〕。盡管AD的發現已有百多年歷史，但目前來看其發病機制仍然不很清楚〔1～3〕。突觸，是兩個神經元功能聯系及信息傳遞非常關鍵的結合點，在神經元之間信息傳遞過程中起著十分重要的作用，是個體認知功能及學習記憶的基礎。盡管 AD 的基本病理改變為老年斑(SP)及神經纖維纏結(NFT)的形成，但越來越多的證據表明，突觸結構和功能缺陷在AD相關記憶衰退中更早的發揮作用〔4～6〕。此外，AD 患者尸檢標本的研究已經證實，在AD的早期就已經檢測到突觸的丟失， AD 患者腦內多種突觸相關蛋白含量下降，突觸功能低下、丟失，其可導致神經元之間的信號傳遞受到影響或者破壞，從而引起認知功能障礙的發生〔7,8〕。因此，防止突觸丟失，維持突觸功能正常有可能是AD治療的主要方法之一〔9〕。α3神經型尼古丁受體(nAChR)在大腦的學習、認知及記憶等功能方面具有非常重要的作用，并且參與了多條信號途徑的調控。α3 nAChR主要分布于大腦的特定區域和脊髓，與神經遞質的傳遞密切相關，在突觸功能的調控中起到一定作用。銜接蛋白(AP)180、發動蛋白(DYN)1兩個蛋白是由網格蛋白介導的并調控突觸囊泡內吞功能的關鍵蛋白，在突觸功能的維持上起著非常重要的作用。本研究采用RNA干擾技術下調人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)α3 nAChR水平對AP180及DYN 1的影響，探討α3 nAChR神經保護作用的可能機制及在AD發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 SH-SY5Y源于ATCC公司； 胎牛血清(FBS)購自Gibco公司(美國)；細胞培養基用杜氏改良培養液(DMEM)高糖培養基、0.25%胰蛋白酶、雙抗購于HyClone公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent、Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購于Roche公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度定量試劑盒、提取RNA用的Trizol試劑、逆轉錄試劑盒均購自Thermo公司(美國)；鼠抗α3 nAChR單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)所標記的抗鼠二抗、α3 nAChR shRNA Plasmid重組質粒均購自美國Santa公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購自Abmart公司；鼠抗DYN1單克隆抗體購于Gene Tex公司(美國)；兔抗AP180多克隆抗體購于Abcam公司(美國)；HRP標記的抗兔二抗購自美國的CST公司。聚偏氟乙烯(PVDF)膜、WB其他相關試劑購于Amersham公司(美國)；擴增α3 nAChR、DYN1、AP180、β-actin引物由上海生工生物有限公司合成；其他常規試劑購于Solarbio公司。

1.2細胞培養和轉染 SH-SY5Y用于10% FBS、1% 雙抗的高糖DMEM中培養，置于飽和濕度、5% CO2、37℃恒溫培養。細胞長至80%～90%，形態良好后將其傳代至6孔板，當細胞匯合度達50%～70%時，用轉染試劑X-treme GENE HP DNA，按質粒：轉染試劑為1∶3的轉染條件，轉染質粒DNA〔10〕，細胞總的分組分為對照組、空載質粒組(control shRNA plasmid)和轉染組(α3 nAChR shRNA plasmid)。轉染6 h后更換含10%FBS及1% 雙抗的DMEM高糖培養基繼續培養，48 h后收集細胞，測定α3 nAChR、DYN1和AP180 mRNA及蛋白水平。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.3Real-time PCR 檢測α3 nAChR mRNA、DYN1、AP180 mRNA水平 用Trizol一步法，提取各對照組及實驗組細胞總RNA并逆轉錄合成cDNA，最后以cDNA為擴增模板，進行Real-time PCR。實驗所用引物序列：α3 nAChR：上游引物：5′-accaccgcaggataaaaatct-3′、下游引物：5′-cactttggatggcttctttga-3′，片段長度126 bp；DYN1：上游引物：5′-gtcaacaagaccgtgaggga-3′，下游引物：5′-tgatgtcgccgatgatgc-3′；片段長度187 bp；AP180：上游引物：5′-ctggagcaggatttggaatg-3′，下游引物：5′-ggaggtttcttgggactctgac-3′；片段長度172 bp；β-actin：上游引物：5′-tggcaccacaccttctacaatg-3′，下游引物：5′-tcatcttctcgcggttggc-3′；片段長度103 bp。用 ABI Step One Plus 實時熒光定量 PCR儀收集擴增循環熒光信號，采用SDS2.1軟件，以β-actin 為內參照，計算α3 nAChR、DYN1、AP180 mRNA的相對表達水平(RQ=2-△△Ct)。實驗重復3次，每次設6個復孔。

1.4Western印跡法檢測α3 nAChR、 DYN1、AP180蛋白水平的表達情況 細胞處理后收集細胞并加入蛋白高效裂解液，冰上裂解3 h，12 000 r/min，離心15 min，上清即為所提取的細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量。Western印跡法檢測α3 nAChR、DYN1、AP180蛋白表達水平，然后用ImageJ軟件，進行目的、內參條帶灰度值分析，最后計算α3 nAChR、DYN1、AP180蛋白條帶、β-actin蛋白條帶之間分析灰度值的百分比。獨立重復實驗3次，每次至少3個復孔。

1.5統計分析 應用SPSS22.0軟件進行方差分析，組與組之間的比較采用LSD-t法，如方差不齊時采用DunnettT3校正檢驗。

2 結 果

2.1α3 nAChR shRNA Plasmid轉染SH-SY5Y后α3 nAChR mRNA及蛋白的表達水平 SH-SY5Y轉染α3 nAChR shRNA Plasmid后α3 nAChR mRNA(0.23±0.040)和蛋白水平(32.63±6.440)分別降低了76%和67%，且與對照組(1.00±0.001，100.00±12.810)及空載組(0.99±0.110，93.28±9.660)相比差異有統計學意義(P<0.01)。而空載質粒組與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2α3 nAChR基因下調后DYN1 mRNA及蛋白的表達水平 與對照組(1.00±0.00，100.00±10.34)比較，轉染組DYN1 mRNA(0.57±0.06)及蛋白表達水平(55.08±8.99)明顯降低(P<0.01)，而空載質粒組(0.94±0.08，93.56±12.22)與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

2.3α3 nAChR基因下調后AP180 mRNA及蛋白的表達水平 與對照組(1.00±0.00，100.00±12.83)比較，轉染組AP180 mRNA(0.56±0.08)及蛋白表達水平(55.74±12.35)明顯降低(P<0.01)，而空載質粒組(0.94±0.05，103.79±14.84)與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖3。

圖1 SH-SY5Y轉染后各組細胞α3 nAChR蛋白表達水平

圖2 SH-SY5Y轉染后各組細胞DYN1蛋白表達水平

圖3 SH-SY5Y轉染后各組細胞AP180蛋白表達水平

3 討 論

nAChR〔11〕是一種非第2信使介導的神經遞質(配體)結合的離子通道，其主要調控細胞內、外K+、Na+及Ca2+等離子的流動。nAChR廣泛分布于神經元的胞體、軸突及樹突〔12〕，與多種神經遞質包括乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺和5-羥色胺的釋放、改變突觸可塑性、大腦學習記憶、智力發育和識別能力等腦功能有關。nAChR由α和β兩種亞單位構成。不同的亞單位以不同的組合(五聚體)構成不同的nAChR亞型，大量研究報道及課題組前期研究均發現〔13〕：AD 患者腦中膽堿能系統嚴重受損，腦組織中多個區域中nAChR水平降低，AD患者大腦AchR數目減少、密度降低。α3 nAChR是nAChRs家族的主要成員之一，在AD患者的腦組織中也發現其表達量明顯降低〔14〕，提示了α3 nAChR可能在突觸功能調節中具有一定作用。

突觸囊泡與突觸前膜融合時，神經遞質釋放到突觸間隙，與突觸后膜上的受體結合完成信息的傳遞。突觸囊泡數量、功能的紊亂，會影響到神經遞質的翻譯及突觸信息的傳遞，進而影響了突觸功能〔15〕。因此，維持突觸囊泡的穩定對延緩AD的發生具有至關重要的作用。AP180是一種多功能蛋白，分布于突觸前神經末端，在突觸囊泡再循環過程及維持突觸囊泡的大小中起著重要作用，能協助完成網格蛋白的包被，同時還能調節突觸囊泡中神經遞質的釋放量〔16〕。DYN1是一種三磷酸鳥苷酶(GTPase)，它的相對分子量為95 kD，其主要分布在突觸前囊泡膜。當突觸囊泡膜上網格蛋白被包被后，網格蛋白會受到DYN1的擠壓及剪切，使存于于突觸前膜上的突觸囊泡解離下來，為下一次神經遞質的釋放做好準備，而其擁有的GTP酶的水解作用對于剪切的過程有促進作用〔17〕。細胞中AP180和DYN1兩個蛋白的表達水平降低會減弱神經細胞回收突觸囊泡的能力，并且導致突觸前末端不能提供足夠的神經遞質，從而導致突觸的正常生理功能受到嚴重影響。近年研究發現AP180和DYN1兩個蛋白在AD患者和模型鼠大腦組織中均有明顯降低〔18〕，這可能是其參與了突觸囊泡循環影響突觸功能有關。

本研究提示α3 nAChR與突觸蛋白密切相關，在突觸功能的發揮中起到十分重要的作用。