大黃對瘢痕成纖維細胞增殖抑制作用及其有效成分研究

陶新宇，曹爽 ，張成義

1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林 132013；2.北華大學(xué)，吉林吉林 132013

增生性瘢痕是創(chuàng)傷后機體組織自我修復(fù)的結(jié)果，屬病理性愈合現(xiàn)象，多見于燒傷后[1]。現(xiàn)階段，國內(nèi)外報道增生性瘢痕治療方法眾多，但大多欠成熟、效果不盡如人意或存在較大的毒副作用[2]。近年，隨著中醫(yī)藥學(xué)在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用和推廣，中藥治療增生性瘢痕受到臨床關(guān)注。目前，已有研究表明黃芩苷、蘆薈大黃素、異澤蘭黃素等中藥有效成分具有抑制成纖維細胞增殖的功能，對控制增生性瘢痕具有積極作用[3]。中醫(yī)研究認(rèn)為，瘢痕乃皮膚表面敗濁之物，外不能發(fā)散于上，內(nèi)不能沉降于下，是其留著于皮膚的主要原因，大黃瀉下降氣，具有解熱毒、破積滯、行瘀血的功效，能下排陰濁之氣，聯(lián)合桔梗清陽外散，對瘢痕具有很好的活化修復(fù)作用[4]，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)鮮見關(guān)于大黃抗增生性瘢痕有效成分及作用機制的研究導(dǎo)報，文章現(xiàn)對此進行分析探討，旨在為增生性瘢痕臨床治療提供參考，具體報道如下。

1 儀器與材料

1.1 材料和相關(guān)儀器

人增生性瘢痕成纖維細胞（HSF）；藥用植物大黃干燥根及莖；DMEM高糖培養(yǎng)基；胰蛋白酶；MTS增殖細胞試劑盒；二甲基亞砜 （DMSO）；HE染色試劑盒；甲醇溶液；色譜儀；細胞培養(yǎng)箱；酶標(biāo)儀；流式細胞儀；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒；PBS緩沖液；UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)等。

1.2 方法

取大黃樣本150 g，研碎后分成5等份，采用索氏提取法，分別以水200 mL、乙酸乙酯200 mL、石油醚200 mL、飽和正丁醇200 mL、氯仿200 mL回流提取，液溫70℃，回流時間5 h。回收溶液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥等處理，分別得到相應(yīng)提取物。取對數(shù)生長的HSF，通過細胞消化、重懸于DMEM高糖培養(yǎng)基等操作，調(diào)整至細胞數(shù)5×104m/L，接種于培養(yǎng)板，100 μL/孔。 培養(yǎng)參數(shù)：CO2濃度 5%，溫度 37℃，時間12 h。之后，分別以水提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、飽和正丁醇提取物、氯仿提取物繼續(xù)培養(yǎng)，各組溶劑濃度均為25 μg/mL，均以DMSO溶液助溶（終濃度＜0.1%）；另以培養(yǎng)溶液0.1%DMSO為對照。各組培養(yǎng) 24 h 后，滴入 MTS 溶液，120 μL/孔，4 h 后取上清液，以酶標(biāo)儀測定490 nm處吸收度（A），利用公式 （1-A樣品/A對照）×100% 計算各組HSF增殖抑制率。收集各組細胞，PBS沖洗，70%乙醇固定，加PI染液和RNaseA，輕輕吹勻，37℃孵育30 min后，以流式細胞儀檢測，利用公式（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）計算各期細胞百分率（%）及增殖指數(shù)PI。根據(jù)細胞增殖試驗結(jié)果，取HSF抑制作用較強的乙酸乙酯提取物，甲醇溶解，微孔濾膜過濾，UPLC分離，并同時按時間收集流出液于深孔板，以高效液色相譜法（HPLC）鑒定高活性成分。同法進行抗增殖作用分析，培養(yǎng)溶液及濃度分別為大黃素（7.4 nmol/mL）、大黃酸（17.5 nmol/mL）、沒食子酸（5.2 nmol/mL），計算各組HSF增殖抑制率后，樣本HE染色，顯微鏡下觀察作用后HSF的細胞學(xué)形態(tài)，評價各組抑制效果。

1.3 統(tǒng)計方法

以SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各提取物HSF增殖抑制率比較

大黃水提取物0.03%、乙酸乙酯提取物17.83%、石油醚提取物5.16%、飽和正丁醇提取物3.37%、氯仿提取物5.22%，對照組0.1%DMSO的HSF增殖抑制率0.08%。乙酸乙酯、石油醚、飽和正丁醇、氯仿提取物HSF增殖抑制率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中以乙酸乙酯提取物作用效果最強。

2.2 各提取物對HSF細胞周期作用分析

流式細胞儀分析結(jié)果示，與對照組相比，乙酸乙酯提取物S期HSF細胞比例下降 （P＜0.05），G2/M期顯著下降（P＜0.01），PI指數(shù)低于其他各提取物，較對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.3 乙酸乙酯提取物成分鑒定及抗HSF增殖驗證

UPLC高活性成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果示，乙酸乙酯提取物中主要含有以下活性成分，見表2。抗HSF增殖結(jié)果示，各活性成分HSF增殖抑制率，沒食子酸41.76%，大黃酸36.7%，大黃素38.3%，均高于對照組0.1%DMSO，抑制效果明顯。HE染色后鏡下觀察HSF，發(fā)現(xiàn)作用后細胞數(shù)量均有減少，并伴不同程度細胞質(zhì)、胞核濃縮，細胞突起變短或缺失。

表1 各提取物下HSF不同周期細胞比例比較（%）

表2 乙酸乙酯提取物UPLC-Q-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析

3 討論

增生性瘢痕是一種較為嚴(yán)重的創(chuàng)傷所致正常皮膚組織外觀形態(tài)及組織病理學(xué)改變，會嚴(yán)重影響美觀，甚至導(dǎo)致功能障礙，造成患者肉體痛苦和精神痛苦。成纖維細胞是疏松結(jié)締組織主要細胞成分，能通過有絲分裂增殖、分泌膠原纖維和基質(zhì)成分等，填補傷口缺損，為表皮細胞覆蓋創(chuàng)造條件，對創(chuàng)傷后組織修復(fù)具有重要作用，其活性增強、過度增殖是增生性瘢痕形成的組織學(xué)基礎(chǔ)，但目前臨床尚未不明確其病因?qū)W機制。不過研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞在一定條件下可同纖維細胞互相轉(zhuǎn)化，也成為該病可逆性治療的理論基礎(chǔ)[5]。

祖國傳統(tǒng)中醫(yī)對瘢痕的治療與研究有著悠久的歷史，并積累的一定的經(jīng)驗，諸多方劑中可見中藥大黃。該次臨床研究運用現(xiàn)代生化手段對大黃治療增生性瘢痕的作用機制進行研究，結(jié)果顯示，大黃乙酸乙酯提取物具有理想的抗HSF增殖活性，抗增值率達17.83%，與文獻報道大黃乙酸乙酯提取物抗HSF增值率（17.65%）相近[7]。經(jīng)UPLC高活性成分質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)主要活性成分沒食子酸、大黃酸和大黃素，前者為多酚類化合物，后兩者為蒽醌類化合物，其抑制率分別為41.76%、36.7%、38.3%，處于較高水平。目前，沒食子酸抗纖維化相關(guān)研究鮮見，臨床關(guān)于大黃酸和大黃素抑制成纖維細胞增殖與轉(zhuǎn)分化的研究報道較多，普遍得到肯定結(jié)論，但研究多見肝臟、腎臟與心肌纖維化[5，8]，對于皮膚增殖性瘢痕的研究較少。另外，也有關(guān)于大黃活性成分蘆薈大黃素-ω-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷抑制瘢痕成纖維細胞作用的研究報道[9]。該研究受條件因素限制為對此進行驗證，也未通過動物試驗進一步研究大黃活性成分治療增生性瘢痕的作用效果，有待深入解決。

綜上所述，大黃乙酸乙酯提取物含有活性成分沒食子酸、大黃酸和大黃素，具有良好的抑制瘢痕成纖維細胞增殖作用，可作為大黃治療增殖性瘢痕物質(zhì)理論依據(jù)參考。