胃癌化療抵抗基因PMP22下游的生物信息學機制

汪圣毅，張永紅，閆亞飛，李旭升，程 彥，李永翔

化療(chemotherapy，CTx)可控制非治愈因素，改善無法手術切除胃癌患者的預后[1]，可降低循環腫瘤細胞數，降低淋巴結、局部和腹膜的復發，附加藥物可逆轉免疫細胞的功能，抑制胃癌細胞的增殖遷移[2]。但CTx亦使癌細胞發生適應性改變，產生耐受或抵抗，與癌細胞基因表達和相關通路的變化有關。外周髓磷脂蛋白22(peripheral myelin protein 22，PMP22)與CTx抵抗、腫瘤發生有關[3]，PMP22表達干預可致下游基因表達變化[4]，其上調與胃癌細胞抵抗順鉑的作用有關[5]，但其下游機制尚不明確。生物信息學方法可揭示疾病基因模塊和網絡，應用廣泛[6]。該研究采用生物信息學方法，比較短發夾核糖核酸敲減和未敲減PMP22的下游差異表達基因(defferentially expressed genes, DEGs)，分析其相關通路，為胃癌CTx抵抗的分子機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、平臺基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO)GSE(基因表達數據庫系列，GEO series)94714胃癌細胞系MGC-803、慢病毒載體(plasmid lentiviral vector，pLKO.1)購自中科院細胞所。PMP22的短發夾核糖核酸(short hairpin RNA，shRNA)共2個，shRNA1： CCAAACTCAAACC AAACCAAA，shRNA2：CGGTGTCATCTATGTGATCT T，Lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)將含有shRNA1、shRNA2的慢病毒轉染至293T細胞擴增，轉染篩選MGC-803，美國安捷倫公司芯片平臺測試基因表達譜[5]。

1.2 表達譜數據PMP22敲減和未敲減組的差異基因表達譜，取自美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)的GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，由Cai et al[5]提交，樣本為：1：數據庫樣本(GEO sample, GSM)GSM2481329；2：GSM2481330；3：GSM2481331；4：GSM2481332；5：GSM2481333；6：GSM2481334，1～3為A組，PMP22_shRNA2敲減PMP22基因的表達，4～6為B組，未抑制PMP22基因的表達。

1.3 差異基因數據庫R語言(GEO to R, GEO2R)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE94714)定義A、B組別，美國國家標準學會(American national standards institute，ANSI)格式保存所有差異基因至.txt文件，導入Excel 2016篩選，篩選條件：① 校正P<0.01；② 倍數變化(fold change，FC)值≥10或≤-10，計算logFC：log2(A/B)=log2(A)-log2(B)，分別為±3.321 928。

1.4 富集和通路分析差異基因于注釋、可視化和綜合發現數據庫(database for annotation, visualization and integrated discovery,DAVID)網站(https://david.ncifcrf.gov/)，分析基因本體(gene ontology，GO)的生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)，分析京都基因和基因組百科全書(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路。選BP、MF、CC中P值最小的前6位，繪制復合條圖。KEGG結果繪制泡泡圖。

1.5 蛋白質相互作用DAVID轉換基因名為官方基因標識，文本正則表達式截取基因名稱，導入互作基因檢索工具(search tool for the retrieval of interacting genes，STRING)數據庫(http://string-db.org/)，Homo Sapiens獲蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)的網絡。數據導入Cytoscape 3.6.1，分子復合檢測(molecular complex detection，MCODE)插件行模塊分析，單一模塊中的基因導入DAVID 6.8行通路分析。

1.6 關鍵基因篩選PPI數據導入Cytoscape 3.6.1，CytoHubba插件篩選關鍵基因，用最大集團中心性(maximal clique centrality，MCC)的拓撲算法。

1.7 癌癥藥物敏感性基因組學數據庫驗證logFC絕對值由高到低排序，前10位的基因和MCC算法獲得的關鍵基因，導入癌癥藥物敏感性基因組學(genomics of drug sensitivity in cancer，GDSC)數據庫，分析與胃癌CTx敏感性的關聯性。

1.8 統計學處理差異表達基因(DEGs)為GEO中R語言limma包完成分析，數據矩陣線性擬合，本雅米尼·霍赫貝格錯誤發現率(false discovery rate，FDR)校正。

2 結果

2.1 樣本數據特征數據歸一化的中位數均為5.4，均數為6.21，中位數位于同一水平，標準化特征良好，見圖1。

圖1 樣本基因表達數據的歸一化結果

1：GSM2481329；2：GSM2481330；3：GSM2481331；4：GSM2481332；5：GSM2481333；6：GSM2481334

2.2 差異基因GEO2R結果獲34 183個與GEO ID對應的序列。AdjustedP<0.01，logFC=3.321 928，篩選到368個對應的ID，刪除無基因庫登錄號(gene bank accession number，GB_ACC)的30行。GB_ACC轉換基因名，獲315個DAVID IDs，Excel查重刪除1個重復，vlookup函數將基因名對應至差異篩選表，找回logFC值，countif函數計算獲上調基因283個，下調31個。logFC絕對值最大的前10位見表1。

表1 logFC絕對值前10位的差異表達基因

EEF1A1：真核翻譯延長因子1α1；HSP：熱休克蛋白；ITGB1：整合素亞單位β1；SLC3A2：印記基因家族3成員2；KDM1A：賴氨酸脫乙基酶1A

2.3 GO和KEGG分析富集到BP、MF、CC的基因分別有271、277、283個，為注釋基因的86.3%、88.2%、90.1%，140個基因(44.6%)參與KEGG通路。BP、MF、CC中P值最小的前6位，換算成-log10(P值)為縱坐標，橫坐標各分類的基因計數為右側y軸繪圖，見圖2。CC中富集在核、膜、核質、細胞外外泌體、細胞黏著連接、蛋白復合體等的基因差異顯著，見圖2A；BP中參與細胞-細胞黏附過程的基因P值最低，參與基因數為19，見圖2B；MF中P值最低的為多聚腺嘌呤核糖核苷酸結合，參與基因數目最多的為蛋白質結合，見圖2C。富集前5位的通路為細胞周期、氨基酸的生物合成、無翅型整合位點家族(wingless-type integration site family， Wnt)、轉化生長因子β、半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路，見圖2D。

2.4 蛋白質相互作用PPI數據導入Cytoscape，MCODE聚類，節點連接度(degree)值=2，節點(node)評分值=0.2，k-分(core)=2，最大深度(max.depth)=100，獲11個模塊，評分前4的模塊4個，評分分別為9、7、5、4.909，Node數目分別為9、7、7、12，邊(Edge)數目分別為36、21、15、27，見圖3。單個模塊中的基因行通路分析，主要與剪接體、泛素介導的蛋白水解共2個KEGG(P<0.01)和3個反應組(REACTOME)(P<0.05)通路關聯，見表2。

表2 PPI網絡模塊中的基因富集通路

R-HSA：反應組人類通路標識碼

2.5 PPI中的關鍵基因MCC算法計算前10個關鍵基因為：肽基脯氨酰異構酶E(peptidylprolyl isomerase E，PPIE)、不均一核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，HNRNPA1)、Y盒結合蛋白1(Y-box binding protein 1，YBX1)、不均一核核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，HNRNPK)、不均一核核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1)、死亡盒解旋酶9(DExH-Box helicase 9，DHX9)、U6小核糖核酸相關Sm樣蛋白(U6 snRNA-associated sm-like protein，LSM4)、小核核糖核蛋白多肽N(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N，SNRPN)、多聚谷氨酰胺結合蛋白1(polyglutamine binding protein 1，PQBP1)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1)，評分分別為41 970、40 395、40 372、40 352、40 346、40 341、40 324、40 324、40 321、2 336，顏色排序見圖4。

圖2 基因本體(GO)分析

圖3 PPI網絡的聚類模塊

A：評分第1的9節點網絡結構；B：評分第2的7節點網絡結構；C：評分第3的7節點網絡結構；D：評分第4的12節點網絡結構

圖4 MCC算法的關鍵基因及其相互作用關系

2.6 差異和關鍵基因與藥物敏感性的關系GDSC分析顯示，富含腺嘌呤胸腺嘧啶蛋白質1A交互域(AT-rich interactive domain-containing protein 1A，ARID1A)基因突變與胃腺癌對CTx藥物的敏感性有關，順鉑作用ARID1A突變的胃癌細胞，半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值升高(P=0.050 016)；卵巢癌、結直腸腺癌ARID1A基因突變時，順鉑作用的IC50值降低，P值分別為0.005、0.047，見圖5。DHX9基因突變與多種癌細胞的藥物敏感性有關，但未見與胃腺癌藥物敏感性的關聯。其他top 10差異基因和MCC篩選的關鍵基因尚無GDSC數據庫資料。

3 討論

PMP22下游基因主要富集在細胞核、膜、核質、胞外外泌體、黏著連接、蛋白復合體等成分，參與細胞-細胞黏附過程、多聚腺嘌呤核糖核苷酸結合、蛋白質結合，參與細胞周期、氨基酸生物合成、Wnt和轉化生長因子β、半胱氨酸蛋氨酸代謝等通路。PPI網絡模塊主要通過剪接體、泛素介導的蛋白水解、熱休克因子1活化、軸突導向因子3A p21活化激酶依賴性軸突排斥、肌動蛋白動力調節形成吞噬杯、縫隙連接等通路發揮作用，與PPIE、ARID1A等有關。

PMP22敲減后ARID1A上調，順鉑敏感性增強，與ARID1A陽性表達胃癌患者無病生存率提高[7]的結果一致。GDSC分析見胃癌細胞順鉑敏感性與ARID1A突變的關聯P值略大于0.05，可能與突變組的樣本量少有關。DHX9突變與胃腺癌以外的其他多種癌細胞的順鉑敏感性有關。Top10差異基因、關鍵基因中的其他基因，GDSC未見記錄，可能是PMP22下游尚未明確的新基因。

GO和KEGG分析顯示，外泌體、細胞黏著粘附、蛋白質結合功能均與PMP22相關CTx敏感性有關。外泌體傳遞miR-155至敏感細胞介導乳腺癌的CTx抵抗[8]。外泌體合成分泌抑制使去勢抵抗的前列腺癌細胞的CTx敏感性增強。細胞黏著連接因E-cadherin丟失而崩解，腫瘤細胞會避開失巢凋亡，CTx抵抗性增強[9]。細胞黏附生物過程的基因P值最小，表明與CTx抵抗顯著關聯。細胞間黏附分子-1中和抗體減少Jurkat細胞與間充質干細胞的黏附，減少細胞間線粒體轉運，使Jurkat細胞的CTx敏感性增強[10]。分子功能中的蛋白質結合功能，通過結合互作調節CTx敏感性。分化抗原133與磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)PI3K-p85的直接作用可活化PI3K/PKB(蛋白激酶B)通路，導致胃癌細胞的多種藥物抵抗[11]。通路方面，胃癌細胞CTx抵抗與Wnt通路的關聯性已有報告[12]，與本文的KEGG分析結果相似，其余未見文獻報道的通路，如泛素化降解與胃癌CTx抵抗的關系，是未來研究的方向。

圖5 ARID1A基因突變與順鉑敏感性的關系

PPI網絡以系統視角揭示CTx抵抗的機制，本研究構建的PPI網絡中提取4個亞模塊，獲10個關鍵基因，其中的DHX9、應激誘導磷蛋白1(STIP1)基因突變與CTx抵抗或敏感性關聯，GDSC得到驗證，尚無驗證的可能是CTx抵抗相關新基因。PPI模塊涉及的剪接體、泛素介導蛋白水解通路與骨肉瘤[13]、結直腸癌的發生發展相關聯[14]，睡美人轉座子突變研究[15]顯示，泛素介導蛋白水解和細胞黏著連接也是胃癌中的失控通路。

本研究顯示了PMP22下游參與CTx抵抗的網絡成員，作為胃癌CTx抵抗的基因標志，為CTx抵抗精準治療的靶點研究提供了參考。